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Reducción asimilatoria de sulfato en el metanógeno marino Methanothermococcus thermolithotrophicus
Nature Microbiology (2023)Citar este artículo
Detalles de métricas
Methanothermococcus thermolithotrophicus es el único metanógeno conocido que crece en sulfato como su única fuente de azufre, uniendo de manera única la metanogénesis y la reducción de sulfato. Aquí utilizamos análisis fisiológicos, bioquímicos y estructurales para proporcionar una instantánea de la ruta completa de reducción de sulfato de esta arquea metanogénica. Encontramos que los pasos posteriores en esta vía son catalizados por enzimas atípicas. La PAPS (3′-fosfoadenosina 5′-fosfosulfato) liberada por la APS quinasa se convierte en sulfito y 3′-fosfoadenosina 5′-fosfato (PAP) por una PAPS reductasa que es similar a las APS reductasas de la reducción disimilatoria de sulfato. A continuación, una fosfatasa de PAP no canónica hidroliza la PAP. Finalmente, la sulfito reductasa dependiente de F420 convierte el sulfito en sulfuro para la asimilación celular. Si bien los estudios metagenómicos y metatranscriptómicos sugieren que la vía de reducción de sulfato está presente en varios metanógenos, la vía de asimilación de sulfato en M. thermolithotrophicus es distinta. Proponemos que esta vía fue 'mix-and-matched' a través de la adquisición de enzimas asimilatorias y disimilatorias de otros microorganismos y luego reutilizada para cumplir una función metabólica única.
Los microorganismos productores de metano más comunes tienen una alta demanda de azufre debido a sus enzimas y metabolismo específicos. Si bien la mayoría de estos metanógenos usan sulfuros (HS−), se ha demostrado que algunos metabolizan estados de oxidación más altos de azufre o incluso sulfuros metálicos (por ejemplo, FeS2) para la adquisición de azufre1,2,3,4,5. Sin embargo, Methanothermococcus thermolithotrophicus es el único metanógeno conocido capaz de crecer en sulfato (\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)) como su única fuente de azufre4,6. El metabolismo de este hidrogenótrofo marino, aislado de sedimentos marinos calentados geotérmicamente cerca de Nápoles (Italia), es paradójico, ya que la reducción de \({\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) debería conducir a varias obstáculos fisiológicos para un microbio productor de metano. En primer lugar, los metanógenos comúnmente prosperan en ambientes sulfurosos reducidos donde todos los aceptores de electrones que no sean CO2 están agotados, incluido \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (refs. 7,8). En segundo lugar, en la interfaz donde coexisten los metanógenos y los iones \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\), los metanógenos hidrogenotróficos deben competir con los \({{\rm{SO}}} disimilares _ {4}^{2-}\)-microorganismos reductores para el sustrato común dihidrógeno (H2)9. En tercer lugar, los metanógenos viven en los límites termodinámicos de la vida y la hidrólisis del trifosfato de adenosina (ATP) junto con la reducción de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) sería una inversión sustancial para tales microorganismos de energía limitada8,10. Finalmente, la vía de reducción \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) genera intermediarios tóxicos que interferirían con los procesos celulares.
Para asimilar \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\), el organismo tendría que capturar el anión y transportarlo a la célula usando un transportador. Dentro de la célula, \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) es activado por una ATP sulfurilasa (ATPS) para generar adenosina 5′-fosfosulfato (APS)11,12,13 . A partir de ahí, los organismos pueden usar diferentes estrategias (Datos extendidos Fig. 1, rutas a–c): (1a) APS se reduce directamente por una APS reductasa (APSR) para generar AMP y \({{\rm{SO}}} _ {3}^{2-}\). (1b) Alternativamente, APS puede fosforilarse aún más a 3′-fosfoadenosina 5′-fosfosulfato (PAPS) por la APS quinasa (APSK). Una PAPS reductasa (PAPSR) reducirá PAPS a \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) y el nucleótido tóxico 3'-fosfoadenosina 5'-fosfato (PAP). El PAP debe hidrolizarse rápidamente a AMP y fosfato inorgánico mediante una PAP fosfatasa (PAPP). En ambos escenarios, el paso final lo lleva a cabo una sulfito reductasa que contiene sirohema, que reduce el \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) a HS−. Este último puede entonces incorporarse a la biomasa. (1c) En una ruta diferente, el grupo sulfito de PAPS se transfiere a otro aceptor para generar metabolitos sulfatados. La ruta 1a es muy similar a la ruta disimilatoria (datos extendidos Fig. 1, ruta 2). Sin embargo, las APSR disimilatorias y las sulfito reductasas disimilatorias son estructural y filogenéticamente distintas de sus contrapartes asimilatorias e indirectamente acoplan sus reacciones a las bombas de membrana, lo que permite la conservación de energía14,15,16.
Se han encontrado genes que codifican enzimas putativas asociadas con la reducción de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) en los genomas de múltiples metanógenos13, incluido M. thermolithotrophicus. Para este metanógeno, se puede plantear la hipótesis de una vía de asimilación teórica, aunque incompleta, \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). Aquí aclaramos la maquinaria de reducción \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) completa de esta arquea y describimos cómo este metanógeno puede convertir \({{\rm{SO}} }_{4}^{2-}\) en un bloque elemental de vida.
Los cultivos desarrollados en Na2S se transfirieron sucesivamente a un medio libre de azufre hasta que no se observó crecimiento. M. thermolithotrophicus mostró un crecimiento robusto cuando se complementó con al menos 100 µM de Na2SO4 en el medio y alcanzó rendimientos celulares similares a los del cultivo cultivado con Na2S. En estas condiciones de cultivo, \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) se consume con el tiempo a medida que aumenta la densidad celular (Fig. 1a). Cuando las células se cultivan solo en Na2S, no se pudo detectar \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (Fig. 1a), lo que indica que M. thermolithotrophicus no está realizando oxidación de sulfuro .
a, cultivos de M. thermolithotrophicus cultivados en Na2S (cuadrados negros, 0,5 mM) y Na2SO4 (cuadrados grises, 0,5 mM). El consumo o la liberación de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) en cultivos de Na2S o Na2SO4 se muestran mediante triángulos negros y grises, respectivamente. Los datos se presentan como media ± sd y los valores individuales se muestran como esferas (n = 3 repeticiones). Las diferencias entre la concentración de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) esperada (0,5 mM) y medida (0,13 mM) para el punto inicial se consideran debidas a un artefacto del medio (ver Métodos). b, M. thermolithotrophicus crecido en Na2SO4 10 mM en tres fermentadores independientes. Los puntos de muestreo están representados por cuadrados grises. c, Molibdato (Na2MoO4) inhibición de arqueas asimiladoras y disimilatorias de Na2SO4. Los experimentos de crecimiento para M. thermolithotrophicus se realizaron por duplicado y para A. fulgidus por cuadruplicado (izquierda) o triplicado (derecha). Los datos se representan como media y para los triplicados y cuadriplicados ± sd d, operón predicho para \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) reducción de la secuencia de escopeta del genoma completo de M termolitotrófico.
Datos fuente
Luego desafiamos el cultivo cultivado en \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) cambiando de condiciones de lote a condiciones de fermentador, donde el H2S puede escapar a la fase gaseosa y no se acumula en comparación a las condiciones del matraz. En este sistema abierto con temperatura y pH controlados, M. thermolithotrophicus creció hasta una densidad óptica máxima (DO) de 600 nm de 6,45 en 19 h (Fig. 1b).
Una forma de determinar si M. thermolithotrophicus se basa en enzimas canónicas de la ruta de reducción \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) es usar molibdato (\({{\rm{ MoO}}}_{4}^{2-}\)). El análogo estructural de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) se une al ATPS y desencadena la molibdolisis, que hidroliza el ATP a AMP y pirofosfato (PPi), lo que provoca el agotamiento de la energía celular17 ,18. Una \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) relación molar de 0,004 :1 es suficiente para inhibir la actividad de las bacterias disimilatorias \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-reductoras durante 168 h, un efecto principalmente debido a la molibdolisis por ATPS19,20, 21 \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) la asimilación también se ve afectada por \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\), como lo demuestran estudios en plantas22. En este último, la inhibición del crecimiento ocurrió cuando \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) estaba en exceso en comparación con \({{\rm{SO}}}_{4} ^{2-}\) y la actividad ATPS se vio notablemente afectada en una proporción de 1:118. Cuando se aplicó en M. thermolithotrophicus, una proporción alta de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):Na2S de 12,5:1 no perturbó el crecimiento del cultivo de Na2S, lo que indica que \ ({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) no interfiere con su metabolismo basal. Por el contrario, una razón \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) de 6.25:1 fue inhibidor para el cultivo \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-cultivo, mientras que una proporción de 1:1 no lo fue (Fig. 1c y Datos extendidos Fig. .2a). \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) adición a la cultura inhibida \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) crecimiento restaurado (Datos extendidos Fig. 2b), lo que indica la reversibilidad de la inhibición y su estricto control por parte de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm {SO}}}_{4}^{2-}\) en lugar de la concentración de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\). En comparación, en Archaeoglobus fulgidus, un archaeon que realiza una reducción disimilatoria de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) para conservar energía, observamos una inhibición del crecimiento a \({{\ rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) relación de 0.001:1 (Fig. 1c y Datos extendidos Fig. 2c). Estos resultados sugieren que M. thermolithotrophicus reduce \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) a través de una ruta de asimilación que contiene un ATPS funcional. Los genes que codifican ATPS y APSK independientes putativos estaban de hecho en el mismo locus en el genoma de la cepa DSM2095 que habíamos vuelto a secuenciar (Fig. 1d) (refs. 13, 23). Para confirmar sus funciones, se caracterizaron más el ATPS y APSK de M. thermolithotrophicus (MtATPS y MtAPSK, respectivamente).
La actividad de MtATPS y MtAPSK expresados de forma recombinante se probó mediante un ensayo acoplado (Fig. 2a y Fig. 1 complementaria) y se midió una actividad específica de 0.070 ± 0.004 µmol de NADH oxidado min−1 mg−1 de MtATPS. En estas condiciones, el paso limitante de la velocidad fue la actividad de la pirofosfatasa. Esto destaca la necesidad de una rápida degradación del pirofosfato (Fig. 2a) para evitar una retroinhibición como se mostró anteriormente para otros ATPS24. Una proporción de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) de 1: 1.25 disminuyó la actividad a la mitad (ver Métodos), corroborando que ATPS también está reaccionando con \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) como se muestra en otros homólogos18,21.
a, Panel superior, reacciones catalizadas por MtATPS y MtAPSK; Panel inferior, la actividad específica de MtATPS y MtAPSK, determinada mediante un ensayo enzimático acoplado. '-' indica la ausencia del reactivo indicado. Los datos se presentan como media ± sd y los valores individuales se muestran como esferas grises (n = 3 repeticiones). b, estructura homodimérica de MtATPS en la que un monómero se muestra en una superficie de color amarillo claro y el otro en una caricatura. c, sitio activo de MtATPS (amarillo) superpuesto al ATPS de Thermus thermophilus HB8 (PDB: 1V47, gris) que contiene el APS que se muestra como bolas y palos con carbonos de color cian. Los residuos involucrados en la unión del sustrato se resaltan en barras y solo se etiquetan los de MtATPS. Los enlaces de hidrógeno entre el ATPS de T. thermophilus y APS se representan como líneas discontinuas. El nitrógeno, el oxígeno, el fósforo y el azufre están coloreados en azul, rojo, naranja y amarillo, respectivamente. d, Conservación de la secuencia entre los homólogos de ATPS. e, estructura homodimérica de MtAPSK en la que un monómero se muestra en una superficie de color naranja claro y el otro en una caricatura. El bucle flexible ilustrado por la línea discontinua no se pudo modelar. En todas las estructuras, los extremos N y C se muestran con una esfera azul y roja, respectivamente. f, Conservación de la secuencia entre los homólogos de APSK. Para d y f, los residuos rojos en negrita están involucrados en la unión del sustrato, mientras que las estrellas rojas y negras son residuos perfectamente conservados, respectivamente.
Datos fuente
La estructura de MtATPS se refinó a una resolución de 1,97 Å y se obtuvo en un estado apo a pesar de la cristalización conjunta con APS y \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (Tabla 1 de datos ampliados ). Si bien el empaque de cristal sugiere un ensamblaje homotetramérico en dos formas cristalinas, la cromatografía de exclusión por tamaño y el análisis de superficie usando PISA (www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/) confirmaron un estado homodimérico similar a los homólogos bacterianos (Datos extendidos Fig. 3a y Figura complementaria 2). La estructura exhibe el pliegue ATPS típico que comprende tres dominios (dominio I, 1–156; dominio II, 164–314 y dominio III, 320–382; Fig. 2b). La interfaz dimérica está organizada principalmente por el dominio III como se observa en T. thermophilus, una diferencia notable en comparación con otros homólogos estructurales (Datos extendidos Fig. 3a, b) (refs. 25, 26, 27). Al igual que muchas bacterias termófilas y arqueas, el dominio III contiene un dominio de unión a zinc (320–343; Datos ampliados, Fig. 3c,d) que podría contribuir a la estabilidad térmica27. La superposición de MtATPS con homólogos estructurales muestra un ligero reordenamiento del dominio probablemente debido a la ausencia de sustrato (Datos ampliados, Fig. 3b). Todos los residuos críticos para la reacción se conservan en MtATPS, lo que sugiere un mecanismo de reacción conservado (Fig. 2c, d, datos extendidos, Figs. 3e, f y 4a, y Fig. 3 complementaria).
El modelo de APS-quinasa de M. thermolithotrophicus, MtAPSK, se refinó a 1,77 Å. MtAPSK forma un homodímero con una organización muy similar a las enzimas bacterianas, lo cual era de esperar debido a su alta conservación de secuencia (Datos extendidos Figs. 4b y 5a). A pesar de la cocristalización y el remojo de los cristales con APS y MgCl2, la estructura MtAPSK se obtuvo en su estado apo con un fosfato unido en la posición esperada del ATP β-fosfato (Fig. 2e y Datos extendidos Fig. 5b,c). El extremo N y la región 125–152 (esta última involucrada en la unión del sustrato28,29) no pudieron modelarse debido a la falta de densidad electrónica. Sin embargo, los residuos que se unen a los sustratos y Mg2+ se conservan (Fig. 2f, Datos extendidos Fig. 5b, c y Fig. 4 complementaria), lo que sugiere que MtAPSK debería ser funcional, como lo confirma el ensayo de enzima acoplada.
Si ATPS y APSK están activos, producirán PAPS, un intermediario que podría seguir las rutas metabólicas 1b o 1c (Datos ampliados Fig. 1). Ambas rutas conducirán a la producción del producto tóxico PAP, que inhibe las sulfotransferasas y las exoribonucleasas, y altera el catabolismo del ARN30,31. Por lo tanto, necesita ser hidrolizado eficientemente por una PAP fosfatasa. Si bien el genoma no contenía ninguna PAP fosfatasa relacionada, se encontró un gen que codifica una supuesta fosfoesterasa (Fig. 1d) en el entorno genómico que alberga los genes ATPS y APSK. Este candidato a PAP-fosfatasa, perteneciente a la familia DHH, se expresó recombinantemente y produjo fosfato inorgánico (Pi) a partir de PAP a velocidades rápidas (50,2 ± 5,9 µmol de Pi liberado min−1 mg−1 de enzima purificada con manganeso). La actividad fue estimulada por la adición de manganeso y mostró una alta especificidad hacia PAP (Fig. 3a).
a, Panel superior, reacción catalizada por MtPAPP; Panel inferior, actividad específica de MtPAPP determinada a través de la producción de Pi (izquierda) y actividad enzimática relativa hacia diferentes nucleótidos (derecha). Los datos se presentan como media ± sd y los valores individuales se muestran como esferas grises (n = 3 repeticiones). b, Organización de MtPAPP mostrada en representación de dibujos animados. Los extremos N y C están resaltados como bolas azules y rojas, respectivamente. El carbono, nitrógeno, oxígeno y fósforo de AMP se colorean como cian, azul, rojo y naranja, respectivamente. c, Vista de primer plano del sitio activo de MtPAPP. Los residuos que coordinan el ion AMP y Mn2+ están resaltados con tiras y coloreados como en b, con los residuos del motivo DHH coloreados en rosa. d, Vista recortada de la estructura de MtPAPP mostrada en representación de superficie y coloreada por su conservación de secuencia en 168 homólogos de arqueas. El degradado de color varía de variable (verde azulado) a conservado (magenta). e, La representación de la estructura secundaria se realizó con ESPript 3.0 (ref. 61). El marco de color corresponde a los diferentes dominios: dominio DHH en verde claro, enlazador en gris y dominio DHHA1 en verde más oscuro. Los residuos perfectamente conservados en 168 homólogos de arqueas se resaltan en rojo y amarillo, respectivamente. Las estructuras secundarias que componen MtPAPP están etiquetadas, en las que las hojas β, las hélices α y los giros β se resaltan como flechas, resortes y TT en negrita, respectivamente.
Datos fuente
Para descifrar el mecanismo de esta fosfatasa PAP no canónica (llamada MtPAPP), la enzima se cocristalizó con manganeso y PAP. La estructura, resuelta por reemplazo molecular con una plantilla generada por AlphaFold2 (refs. 32, 33), se refinó a una resolución de 3,1 Å y contenía el producto AMP y un ion en su sitio activo, modelado como un Mn2+ parcialmente ocupado (Tabla de datos extendida 1). Si bien la secuencia de MtPAPP no se alinea con los homólogos que pertenecen a la familia DHH (excepto el motivo DHH), comparte un pliegue general similar a la exonucleasa RecJ o la oligoribonucleasa NrnA de Bacillus subtilis (BsNrnA, que también exhibe actividad PAP-fosfatasa; Datos extendidos Fig. 6a) (refs. 34,35,36). El monómero se compone de un dominio N-terminal (DHH, residuos 1-180) y un dominio C-terminal (DHHA1, residuos 211-315) interconectados por una región enlazadora (residuos 181-210), formando un surco central (Fig. 3b). El dominio DHH contiene el sitio catalítico y el dominio DHHA1 sirve como andamio para unir el sustrato con alta especificidad (Fig. 3b, c y datos extendidos, Fig. 6b). El motivo que coordina el ion Mn2+ en RecJ y BsNrnA está perfectamente conservado en MtPAPP34,36, por lo que esperamos que en su estado activo, MtPAPP esté cargado con dos Mn2+. El primero, parcialmente observado en la estructura, está coordinado por cuatro aspartatos (Asp8, Asp10, Asp57, Asp127) y una interacción de largo alcance con His6. El segundo Mn2+ ausente estaría coordinado por Asp10, Asp57, Asp127, el motivo DHH (His76, His77), así como por moléculas de agua (Datos extendidos Fig. 6c). Si bien el AMP comparte una localización similar con los homólogos estructurales (β9β10β11), está unido por una interacción diferente con la proteína (Datos extendidos Fig. 6b y Fig. 5 complementaria). Idealmente, el sitio de unión de nucleótidos colocaría el 3′-fosfato del PAP frente al manganeso cuando la enzima está en su estado cerrado (Datos extendidos Fig. 6c). El movimiento entre dominios, permitido por el enlazador, facilitaría un intercambio rápido de sustrato/producto, aumentando la rotación de MtPAPP. La secuencia completa de esta PAP fosfatasa se encontró en el genoma de 168 arqueas en las que se conserva el sitio de unión de nucleótidos (Fig. 3d, e y Fig. 6 complementaria). Esto sugiere una enzima común en las arqueas para desintoxicar la PAP (datos ampliados, Fig. 7a).
No se encontraron genes que codifiquen una PAPS reductasa canónica (ruta 1b) o una sulfotransferasa (ruta 1c) en el genoma de M. thermolithotrophicus. Sin embargo, los genes anotados como APS reductasa disimilatoria (subunidad α y β, APSR; Datos extendidos Fig. 7b y Fig. 7 complementaria) están presentes y coexisten con los genes descritos anteriormente (Fig. 1d).
Para confirmar experimentalmente la actividad y la especificidad del sustrato de esta enzima similar a la APS-reductasa, ambas subunidades se coexpresaron en Escherichia coli, se purificaron y analizaron para ensayos de actividad enzimática (Fig. 4a). En contraste con los APSR disímiles que catalizan la reducción reversible de APS a AMP y \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) (refs. 37,38), no pudimos medir el reacción inversa (es decir, AMP y \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\), o PAP y \({{\rm{SO}}}_{3}^ {2-}\) como sustratos) para la enzima M. thermolithotrophicus usando K3Fe(CN)6 como aceptor de electrones. En su lugar, utilizamos un ensayo de enzimas acopladas para reconstituir la vía in vitro (Datos ampliados, Fig. 8). Se utilizaron MtATPS, una pirofosfatasa y MtAPSK para generar PAPS y se añadió MtPAPP para eliminar PAP, un retroinhibidor potencial de la reacción39. La actividad se controló mediante la oxidación de metil viológeno reducido (MVred). Cuando todos los componentes estaban presentes, se midió una actividad enzimática específica de 0,114 ± 0,007 µmol de MV oxidado min-1 mg-1 de la enzima similar a la APS-reductasa. Un exceso de cinco veces de la enzima similar a la APS-reductasa dio como resultado un aumento del 220 % de la actividad enzimática específica, lo que indica que la enzima era el paso limitante de la velocidad de la reacción (Datos ampliados, Fig. 8c). Sin embargo, la acumulación de PAP (inducida por la eliminación de MtPAPP o Mn2+) inhibió fuertemente la actividad. La actividad enzimática específica con APS como sustrato (es decir, la eliminación de MtAPSK) fue de 0,007 ± 0,001 µmol de MV oxidado min-1 mg-1 de la enzima similar a la APS-reductasa (Fig. 4a). Teniendo en cuenta la complejidad de este ensayo de enzimas acopladas, no se pudieron determinar los parámetros cinéticos. Sin embargo, el ensayo proporcionó información sobre la especificidad del sustrato y confirmó que la enzima similar a la APS-reductasa de M. thermolithotrophicus exhibe rasgos de una PAPS reductasa.
a, Panel superior, reacción catalizada por MtPAPSR; Panel inferior, actividad enzimática relativa de MtPAPSR, determinada mediante un ensayo enzimático acoplado (Datos ampliados, Fig. 8). Los datos se presentan como media ± sd y los valores individuales se muestran como esferas grises (n = 3 repeticiones). b, organización MtPAPSR con un heterodímero en representación de superficie y el otro en dibujo. Los términos N y C de ambas subunidades se muestran como bolas y se colorean en azul y rojo, respectivamente. Los socios heterodiméricos están etiquetados con un primo. El carbono, el nitrógeno, el oxígeno, el fósforo, el hierro y el azufre están coloreados en limón, azul, rojo, naranja, marrón y amarillo, respectivamente. c, Primer plano de los cofactores y el flujo de electrones. Los grupos [4Fe-4S] y las cisteínas que los coordinan, FAD y el Trp42 propuesto para participar en la transferencia de electrones se muestran en barras y bolas y se colorean como en b. d, e, sitios activos de APSR (d) de A. fulgidus que contienen APS (AfAPSR, PDB: 2FJA) y MtPAPSR con un PAPS modelado artificialmente (e) que se muestra con una superficie transparente. Los residuos involucrados en el reconocimiento del sustrato (basado en PAPS modelado) están en bolas y palos y están coloreados como en b. Una flecha roja apunta a donde PAPS chocaría. f, Conservación de la secuencia en la subunidad alfa de MtPAPSR, AfAPSR, Megalodesulfovibrio gigas (DgAPSR, PDB: 3GYX) y el supuesto APSR de Caldanaerobius fijiensis (CfAPSR, WP_073344903), que comparte un 68 % de identidad de secuencia con MtPAPSR. Los residuos involucrados en la unión de APS para APSR están en negrita y en rojo; los residuos perfectamente y bien conservados se destacan con estrellas rojas y negras, respectivamente. Trp206 y Tyr207 están involucrados en la unión de FAD. El alineamiento de secuencias se realizó con MUSCLE62.
Datos fuente
Para obtener más conocimientos moleculares sobre la enzima no convencional similar a la APS-reductasa de M. thermolithotrophicus, la enzima se cristalizó en condiciones anaeróbicas. La estructura se resolvió mediante un experimento de dispersión anómala de longitud de onda única medido en el borde K de Fe y refinado a una resolución de 1,45 Å (Tabla 1 de datos ampliados). El complejo se organiza como un heterotetrámero α2β2, con el mismo ensamblaje que las APS reductasas disimilatorias (Fig. 4b y Datos ampliados Fig. 9). Es, sin embargo, drásticamente diferente de las APS/PAPS reductasas asimilatorias de dominio único caracterizadas, que son dependientes de tiorredoxina/glutatión. Las reductasas APS/PAPS asimilatorias no comparten secuencia ni homología estructural con la enzima de M. thermolithotrophicus, y varios motivos que se proponen para mediar la unión al sustrato y la actividad catalítica en las reductasas APS/PAPS asimilatorias están ausentes (Datos ampliados Fig. 9) (ref. 40 ).
En M. thermolithotrophicus, la subunidad α, que contiene el dinucleótido de flavina y adenina (FAD), es miembro de la familia de las fumarato reductasas37,41,42 y la subunidad β está compuesta principalmente por un dominio similar a la ferredoxina en el que dos [4Fe-4S ] Los grupos están coordinados por ocho residuos de cisteína (Fig. 4c). Si bien no existen homólogos asimilatorios de la P/APS-reductasa de la enzima de M. thermolithotrophicus, comparte un 38 % de identidad de secuencia con la subunidad α de la APS reductasa disimilatoria de A. fulgidus (AfAPSR PDB: 2FJA, rmsd de 1,02 Å para 437 Cα alineados). en la subunidad α). Los residuos que coordinan APS, invariables en la familia disimilatoria, difieren en M. thermolithotrophicus y podrían provocar un cambio de especificidad de APS a PAPS. A pesar de un breve remojo con PAP, el bolsillo de sustrato putativo contiene solo solvente, y usamos AfAPSR para modelar artificialmente PAPS en el sitio activo de la enzima (Fig. 4d, e). Las diferentes sustituciones realizadas principalmente por el bucle 104–123 acomodarían el grupo 3′-fosfato adicional mediante interacciones de puente salino y enlaces de hidrógeno (Fig. 4d–f). Sin embargo, en las APS reductasas, una glutamina conservada (α145 en A. fulgidus) chocaría con este grupo fosfato. Los residuos catalíticos propuestos en las APS reductasas disimilatorias se retienen en la enzima de M. thermolithotrophicus (Datos extendidos Fig. 9 y Fig. 7 complementaria). Por lo tanto, proponemos un mecanismo de reacción idéntico basado en un ataque nucleofílico del átomo N5 de FAD en el PAPS de azufre, lo que crea un intermedio FAD-PAPS que decae en PAP y FAD-\({{\rm{SO}}} _ {3}^{2-}\) (refs. 37,42). Tomando en conjunto las tasas de enzimas y el análisis estructural, proponemos que M. thermolithotrophicus alberga una clase única de PAPS reductasa (MtPAPSR) utilizada para convertir PAPS en \({{\rm{SO}}}_{3}^{2- }\) y PAP.
El \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) generado por MtPAPSR debe reducirse aún más a HS−. En los metanógenos hidrogenotróficos, \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) daña la maquinaria generadora de metano y debe ser detoxificado por la sulfito reductasa dependiente de F420 (Fsr)23,43. Anteriormente identificamos y caracterizamos el Grupo I Fsr en M. thermolithotrophicus (MtFsr) y determinamos una actividad enzimática robusta hacia \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) (ref. 23). Además de una segunda isoforma de Fsr, M. thermolithotrophicus no contiene otras sulfito reductasas potenciales. Si bien la espectrometría de masas confirmó que el Fsr aislado de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-células cultivadas es el MtFsr del Grupo I caracterizado, el papel fisiológico de la segunda isoforma de Fsr permanece desconocido23. Por lo tanto, MtFsr es el mejor candidato para catalizar la reducción final de \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) a HS−. La electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE nativa) con extractos celulares de cultivos cultivados en diferentes sustratos de azufre confirmó la ausencia de MtFsr en células cultivadas en Na2S y su alta abundancia en células cultivadas en \({{\rm{SO}}}_{3 }^{2-}\) (refs. 23,43).
Determinamos una actividad de sulfito reductasa específica de 18,42 ± 0,13 µmol de MV oxidado min−1 mg−1 de extracto celular de células cultivadas con Na2SO3, en comparación con 7,31 ± 0,63 µmol de MV oxidado min−1 mg−1 de extracto celular de Las células cultivadas con Na2SO4, mientras que el extracto celular de un cultivo cultivado con Na2S tenía una actividad de sulfito reductasa específica de 3,04 ± 0,25 µmol de MV oxidado min−1 mg−1 (Fig. 5a). De acuerdo, observamos una banda compatible con Fsr en la PÁGINA nativa para el cultivo cultivado en \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) pero en cantidades más bajas en comparación con \({ {\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) condiciones (Fig. 5b). La estructura de MtFsr publicada recientemente por nuestro grupo se obtuvo a partir de células cultivadas en \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\), lo que confirmó que es la misma enzima expresada en \( {{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) condiciones23. En conjunto, estos resultados argumentan que MtFsr se usa como la última enzima en la vía de reducción \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (Fig. 5c).
a, Actividad de sulfito-reductasa en extracto celular de M. thermolithotrophicus cultivado en diferentes fuentes de azufre. Los datos se presentan como media ± sd y los valores individuales se muestran como esferas grises (n = 3 réplicas biológicamente independientes). b, gel de hrCN con extracto de células de M. thermolithotrophicus cultivadas en diferentes fuentes de azufre (15 µg de proteína cargada por muestra, n = 2 duplicados biológicamente independientes). c, Vía de asimilación propuesta de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) en M. thermolithotrophicus. Los fondos amarillo y gris resaltan las vías de reducción y metanogénesis \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\), respectivamente. Las flechas gruesas indican altos flujos metabólicos. Las estructuras de las enzimas que operan la vía de asimilación \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) se muestran en representación superficial, con ligandos como bolas y palos. Las enzimas se abrevian como sigue: Fwd/Fmd, formilmetanofurano deshidrogenasas; Ftr, tetrahidrometanopterina (H4MPT) formiltransferasa; Mch, metenil-H4MPT ciclohidrolasa; Mtd, metileno-H4MPT deshidrogenasa; Mer, 5,10-metileno-H4MPT reductasa; Mtr, N5-CH3-H4MPT: coenzima M metiltransferasa; Mcr, metil-coenzima M reductasa; Adk, adenilato quinasa; Frh, [NiFe]-hidrogenasa reductora de F420; Eha/Ehb, hidrogenasa convertidora de energía. Se propone que los transportadores \({\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) putativos que pertenecen a la clase DASS/SUIP sean WP_018154444/WP_018154062 y la pirofosfatasa WP_018154121.
Datos fuente
Los metanógenos comúnmente usan HS− como fuente de azufre, y los que expresan Fsr tipo I también pueden crecer en \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) (refs. 13,23 ,43). Curiosamente, algunos metanógenos tienen genes que codifican proteínas de la vía de reducción \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) completa o parcial (Figura complementaria 8) (ref. 13) . Entonces, ¿por qué M. thermolithotrophicus es el único metanógeno hasta ahora que se ha demostrado que crece en \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)? Usamos Methanocaldococcus infernus como organismo modelo para investigar esto más a fondo. M. infernus es un hipertermófilo marino que comparte una fisiología muy similar a M. thermolithotrophicus y puede crecer en el mismo medio. Contiene todos los genes que codifican las enzimas caracterizadas en este estudio excepto el PAPSR descrito. Sin embargo, el genoma de M. infernus codifica para un PAPSR y un APSR putativos dependientes de tiorredoxina, que comparten identidades de secuencia alta con el APSR y el PAPSR asimilatorios caracterizados bioquímicamente de M. jannaschii (Fig. 6a y datos extendidos, Fig. 7b) (refs. 44 ,45). Por lo tanto, según la información genómica, M. infernus debería poder asimilar \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\).
a, Methanocaldococcus infernus tiene el potencial genómico para realizar toda la ruta de asimilación \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). WP_013099421 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 59,68 % con MtPAPP, WP_013099422 tiene una identidad de secuencia de 70,60 % con MtATPS y WP_157198836 tiene una identidad de secuencia de 75,44 % con MtAPSK. El APSR (WP_013100115) y PAPSR (WP_013099852) son similares al APSR y PAPSR caracterizados bioquímicamente de M. jannaschii (68,64 % y 58,35 % de identidad de secuencia de aminoácidos, respectivamente), que han demostrado reducir APS/PAPS44,45. WP_013099852 no es homólogo a MtPAPSR pero sí a WP_018154242, una supuesta PAPS reductasa en M. thermolithotrophicus. WP_013100746 tiene una identidad de secuencia del 65,30% con el Grupo I MtFsr. b, Crecimiento de M. thermolithotrophicus y M. infernus en Na2S 2 mM, sin fuente adicional de azufre, Na2SO3 2 mM, Na2SO4 2 mM o Na2SO4 2 mM con Na2S 2 mM. El \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) entre paréntesis indica que se usó como sustrato de azufre para el inóculo. Están representadas las DO600nm máximas de los cultivos, por triplicado, mostradas como media ± sd Los cultivos de M. infernus cultivados sin azufre, Na2SO4 y en Na2S con Na2SO4 están por duplicado. El punto de datos individual de cada réplica se muestra como una esfera.
Datos fuente
M. thermolithotrophicus y M. infernus se cultivaron en el mismo medio y en las mismas condiciones de cultivo, excepto que M. infernus se mantuvo a 75 °C y M. thermolithotrophicus a 65 °CM. infernus creció en Na2S y Na2SO3 2 mM, pero no pudo use \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) como única fuente de azufre en contraste con M. thermolithotrophicus (Fig. 6b).
Esto plantea la pregunta sobre la función fisiológica de los genes relacionados con la asimilación de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) en arqueas metanogénicas. Según nuestros datos, podría ser que otros metanógenos aún requieran estas enzimas para adquirir azufre a través de la ruta 1c (Datos extendidos Fig. 1). El grupo azufre sería transferido a un aceptor por una sulfotransferasa no canónica, que podría ser importante para vías biosintéticas desconocidas. Esto podría explicar por qué el gen que codifica PAPP todavía está presente en los metanógenos que también albergan los genes que codifican un ATPS y un APSK. Un contraargumento a esta hipótesis es la presencia del PAPSR o APSR dependiente de tiorredoxina, caracterizado en M. jannaschii, que más bien aboga por la ruta 1b (refs. 13, 44, 45). Vale la pena señalar que el gen que codifica este APSR asimilatorio putativo también existe en M. thermolithotrophicus (WP_018154242.1). Por lo tanto, se necesitarán más investigaciones bioquímicas para dilucidar las funciones fisiológicas de estas enzimas en los metanógenos.
Este trabajo reveló el exclusivo metabolismo de asimilación \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) de una arquea metanogénica, ofreciendo una instantánea molecular del conjunto completo de enzimas involucradas en la vía. M. thermolithotrophicus activa \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) mediante ATPS y APSK convencionales, pero lo transforma aún más mediante enzimas no canónicas (Fig. 5c).
La PAPS producida por la APSK generalmente se metaboliza por PAPS reductasas asimilatorias dependientes de tiorredoxina o glutatión, que se organizan como homo-oligómeros. Por el contrario, MtPAPSR heredó la organización heterotetramérica y el mecanismo catalítico basado en FAD de las APS reductasas disimilatorias (Fig. 4 y Datos extendidos, Figs. 1 y 9). Proponemos que la sustitución de solo unos pocos aminoácidos cambió la especificidad hacia PAPS (Fig. 4d-f), lo que podría haber sido el resultado de una adaptación evolutiva afinada para promover \({{\rm{SO}} }_{4}^{2-}\) reducción. Sería interesante intercambiar los residuos que confieren las características de PAPSR en el sitio activo (Ser122, Lys120, Arg121) con los de APSR y observar los efectos sobre la afinidad por el sustrato.
El PAP generado es hidrolizado eficientemente por MtPAPP. Esta PAP fosfatasa pertenece a la familia de fosfoesterasas DHH y comparte homología estructural con exonucleasas pero no tiene homología de secuencia con ellas. En comparación, las fosfatasas de PAP convencionales (parte de la superfamilia FIG) tienen un plegamiento diferente (es decir, CysQ) y usan tres iones de magnesio para hidrolizar el 3′-fosfato de PAP30. MtPAPP parece ser un ejemplo notable de evolución convergente, que ilustra cómo las arqueas desarrollaron su propio aparato para desintoxicar la PAP de manera eficiente.
El grupo I Fsr cataliza el paso final de la vía de reducción \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). Esta enzima muestra características distintas de las sulfito reductasas disimilatorias, con la composición del sitio activo de una asimilatoria23. Al codificar el gen fsr en un locus diferente y muy probablemente bajo un regulador diferente para su expresión (por ejemplo, un sensor de sulfito), el metanógeno puede desacoplar \({{\rm{SO}}}_{3}^ {2-}\) desintoxicación a partir de la expresión de toda la \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) maquinaria de asimilación. Mientras que MtATPS, MtAPSK y MtPAPSR muestran tasas catalíticas bastante lentas (ver Discusión complementaria), MtFsr y MtPAPP tienen actividades específicas altas en comparación con los primeros pasos, lo que desencadena el equilibrio hacia la producción de HS− y elimina de manera eficiente los intermediarios tóxicos. Aunque nuestra vía propuesta (Fig. 5c) permitiría una termodinámica favorable, las primeras reacciones deben regularse para evitar la hidrólisis innecesaria de ATP. Sospechamos que MtATPS, MtAPSK y MtPAPSR están regulados de forma cruzada por la acumulación de sus propios productos, como ya se ha demostrado para los homólogos39,46,47, lo que permitiría un retrocontrol directo para armonizar el flujo de azufre intracelular.
M. thermolithotrophicus vive en el límite termodinámico de la vida, pero la asimilación \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) descrita requiere la hidrólisis de tres ATP a ADP para un \({ procesado {\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). Sin embargo, se espera que en condiciones naturales, el beneficio de fijar \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) compense el gasto de energía. Los cultivos cultivados en \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) no se ven obstaculizados por el requerimiento de energía adicional, lo que puede explicarse por nuestras condiciones de cultivo que proporcionan un alto y constante H2 presión parcial. En condiciones ambientales, con una presión parcial de H2 más baja y fluctuante, es probable que el crecimiento en \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) sea más desafiante para M. thermolithotrophicus. Si bien el metanógeno no puede evitar la inversión de ATP, puede haber encontrado una estrategia de ahorro de energía para la reacción de reducción de 8 electrones de PAPS a HS−. Fsr oxida F420H2, que es reducido por la hidrogenasa reductora de F42023,48. F420H2 o NAD(P)H serían donadores de electrones ventajosos para MtPAPSR, pero requerirían la asistencia de una oxidasa asociada que aún no se ha identificado. Alternativamente, el MtPAPSR independiente puede depender de la ferredoxina reducida, que podría obtenerse de la reducción de la ferredoxina dependiente de H2 a través del complejo Eha/Ehb, otra estrategia ventajosa de los hidrogenótrofos para proporcionar poder reductor para impulsar las reacciones anabólicas (propuesta en la Fig. 5c) ( referencia 49).
Hasta ahora, parece que el proceso concomitante de metanogénesis y la reducción completa de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) a HS− está restringido a M. thermolithotrophicus. Sorprendentemente, la única diferencia aparente entre M. thermolithotrophicus y otros metanógenos con potencial genómico para realizar una reducción de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) es la adquisición de una PAPS reductasa, que parece pertenecer a la familia disimilatoria (Fig. 8 complementaria, Fig. 7b de datos extendidos y Discusión complementaria). Queda por descubrir la función fisiológica de estos genes asociados a la reducción de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) en otros metanógenos, así como las ventajas de asimilar \({ {\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) para M. thermolithotrophicus. Desde un punto de vista ecológico, podría ser beneficioso, si no esencial, para la supervivencia de M. thermolithotrophicus poder cambiar de absorción de H2S a \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-} \) reducción en condiciones ambientales (ver Discusión Complementaria).
El trasplante del sistema de reducción de M. thermolithotrophicus \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) en huéspedes metanogénicos, que ya se utilizan como convertidores de gas (por ejemplo, Methanothermobacter), evitar la necesidad de H2S altamente tóxico y explosivo mediante el uso de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) económicos y abundantes. Más allá de abrir posibilidades fantásticas para aplicaciones biotecnológicas más seguras, un metanógeno hidrogenotrófico reductor de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) también refuerza la pregunta sobre el alcance de una metanogénesis entrelazada y una reducción de sulfato. camino durante la evolución de las primeras arqueas. Es muy probable que M. thermolithotrophicus haya ensamblado toda la vía de reducción de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) progresivamente a través de un escenario de 'combinar y combinar', proporcionando una ventaja competitiva bajo las condiciones fluctuantes de la fuente de azufre y la expansión de sus nichos ecológicos.
Se obtuvieron células de M. thermolithotrophicus (DSM 2095), M. infernus (DSM 11812) y A. fulgidus (DSM 4304) del Leibniz Institute DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (Braunschweig, Alemania). M. thermolithotrophicus y M. infernus se cultivaron en el mismo medio mínimo descrito anteriormente con algunas modificaciones23 (consulte Datos ampliados para conocer la composición completa de los medios).
El crecimiento celular se siguió espectrofotométricamente midiendo la DO600. La pureza del cultivo se comprobó mediante microscopía óptica. Los metanógenos se cultivaron con 1 × 105 Pa de H2:CO2 en una proporción de 80:20 en fase gaseosa. M. infernus se cultivó a 75 °C en matraces de suero de vidrio de 250 ml y M. thermolithotrophicus se cultivó a 65 °C en matraces o fermentadores. Los matraces de suero no se agitaron sino que se pusieron en reposo. A. fulgidus se cultivó en tubos Hungate de 22 ml anaerobios y sellados, con 0,8 × 105 Pa N2:CO2. El cultivo DSM 4304 (0,5 ml) se cultivó en 10 ml de medios clásicos (consulte Materiales complementarios para conocer la composición completa de la composición de los medios) que contenía una concentración final de 20 mM de d/l-lactato. El cultivo se incubó a 80 °C, en reposo. Todos los cultivos se almacenaron a temperatura ambiente en la oscuridad en condiciones anaeróbicas. Para el medio de A. fulgidus, encontramos que las altas concentraciones de molibdato lo hacían inestable. Una de las botellas con una alta concentración de MoO42− se volvió amarilla (sin relación con la contaminación por O2) y se omitió, lo que resultó en cultivos por triplicado en lugar de por cuadruplicado (Fig. 1c, panel derecho).
Células de M. thermolithotrophicus cultivadas en Na2S 2 mM se transfirieron sucesivamente a 10 ml de medio de cultivo sin azufre. Después de dos transferencias, la concentración de azufre remanente del inóculo no favoreció el crecimiento de M. thermolithotrophicus. Complementando Na2SO4 2 mM, se reanudó el crecimiento de M. thermolithotrophicus. No se añadió ningún agente reductor para hacer frente a la ausencia de HS-, que normalmente establece un entorno reductor adecuado. La incubación sin agitación es particularmente importante para la reproducibilidad. Por lo tanto, después de la inoculación, los cultivos se incubaron a 65 °C, permanecieron en reposo durante una noche y luego se agitaron a 180 revoluciones por minuto (rpm) hasta que alcanzaron su máxima DO600. La fase gaseosa se refrescó después de la incubación durante la noche para mantener la presión a 1 × 105 Pa de H2:CO2. Para medir la concentración mínima de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) necesaria para mantener el crecimiento, se utilizaron células de M. thermolithotrophicus limitadas en azufre (usando una proporción de inóculo a medio de 1:20 ) recibieron Na2SO4 2 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM, 0,1 mM y 0,04 mM. El crecimiento todavía era observable para las células cultivadas en Na2SO4 0,1 mM pero no en 0,04 mM.
Se usó cromatografía iónica (cromatógrafo iónico Methrom) para medir las concentraciones de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\), analizadas a través del software IC MagIC Net 3.2. Se requirió un volumen de 8 ml por muestra, con una concentración máxima de 0.5 mM \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-células de M. thermolithotrophicus reductoras se cultivaron en botellas Duran de 1 l con 100 ml de medio libre de azufre, que se complementó con 0,5 mM \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) antes de la inoculación. Como control negativo, se usaron células de M. thermolithotrophicus cultivadas con Na2S 0,5 mM, se inocularon y recolectaron de manera similar a los cultivos reductores \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). Todas las muestras se tomaron aeróbicamente y se pasaron a través de un filtro de 0,45 µM (Sartorius). Si las densidades celulares eran demasiado altas para filtrarlas, las muestras se centrifugaban a 13 000 × g durante 7 min a 4 °C y se tomaba el sobrenadante para realizar mediciones de cromatografía iónica. Las muestras se almacenaron a 4 °C si las mediciones no se realizaban inmediatamente.
M. thermolithotrophicus se cultivó en tres fermentadores independientes a 60 °C, con Na2SO4 10 mM como única fuente de azufre. Para cada fermentador, se burbujearon continuamente con H2:CO2 (80:20, 3 l min-1) 7 l de medio de cultivo anaeróbico (ver Medio de cultivo libre de azufre para Methanococcales) suplementado con Na2SO4 10 mM. Bajo agitación (220 rpm), el medio se inoculó con 360 ml de precultivo (con una DO600 superior a 3). Una hora después de la inoculación, el cultivo se agitó a 800 rpm. Se utilizó NaOH (1 M) como base para reajustar el pH tras la acidificación, que se controló con una sonda de pH. Las células se cultivaron hasta la fase exponencial tardía (OD600 de 6,25–6,8) y luego se transfirieron inmediatamente a una tienda anaeróbica (atmósfera de N2:CO2 en una proporción de 90:10). Las células se recogieron mediante centrifugación anaeróbica durante 30 min a 6000 × g a 4 °C. La DO600nm más alta registrada para M. thermolithotrophicus en un fermentador cultivado en SO42 fue de 6,8 después de 20 h. \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) El cultivo (7 l) con una OD600 de 6,8 produjo 54 g de células (peso húmedo). El sedimento celular se transfirió a una botella sellada, se gaseó con 0,3 × 105 Pa N2, se congeló instantáneamente en N2 líquido y se almacenó a -80 °C.
Las secuencias de ADN de las subunidades α y β de ATP sulfurilasa, APS quinasa, PAP fosfatasa y PAPS reductasa de M. thermolithotrophicus se optimizaron por codones para E. coli, se sintetizaron y clonaron en vectores pET-28a(+). Para MtATPS, MtAPSK y MtPAPP, se utilizaron los sitios de restricción NdeI y BamHI, con un codón de terminación (TGA) incorporado antes de BamHI. Para MtPAPSR, se colocó una etiqueta His en el extremo C de la subunidad α y se insertó un sitio de unión al ribosoma entre las secuencias codificantes de las subunidades α y β. La construcción MtPAPSR tenía los sitios de restricción NcoI y BamHI, con un codón de terminación incorporado después de la etiqueta His para la subunidad α y un codón de terminación antes de BamHI para la subunidad β. Estos pasos fueron realizados por GenScript (GenScript). Todas las secuencias utilizadas se detallan en Información complementaria en Construcciones y optimización de codones de genes.
Todas las construcciones se sobreexpresaron y purificaron en condiciones aeróbicas siguiendo un protocolo similar, excepto MtPAPSR, que se sobreexpresó y se purificó en una atmósfera anaeróbica. Todas las enzimas se pasaron a una columna de alto rendimiento HisTrap (GE Healthcare), seguidas, si fue necesario, por división de etiquetas y filtración en gel (consulte Materiales complementarios para ver el protocolo completo).
MtATPS, MtAPSK y MtPAPP purificados se mantuvieron en Tris/HCl 25 mM pH 7,6, glicerol al 10% v/v, ditiotreitol 2 mM y NaCl 150 mM. MtPAPSR se mantuvo en el mismo tampón sin NaCl. Las muestras no congeladas recién preparadas se usaron inmediatamente para la cristalización. Los cristales de MtATPS, MtAPSK y MtPAPP se obtuvieron en condiciones aeróbicas a 18 °C. Los cristales de MtPAPSR se obtuvieron anaeróbicamente (N2:H2, proporción de gas de 97:3) mediante cribado inicial a 20 °C. El método de gota sentada se realizó en placas de cristalización de 2 gotas MRC de 96 pocillos en poliestireno (SWISSCI) que contenían 90 µl de solución de cristalización en el depósito.
Se mezcló MtATPS (0,7 µl) a una concentración de 14 mg ml−1 (MtATPS forma 1, tabla de datos ampliados 1) o a una concentración de 27 mg ml−1 (MtATPS forma 2) con 0,7 µl de solución de depósito. MtATPS a 27 mg ml−1 se cocristalizó con AMPcPP 2 mM y Na2SO4 2 mM. Para la forma 1 de MtATPS, aparecieron cristales transparentes en forma de estrella después de algunas semanas en las siguientes condiciones de cristalización: etoxilato de pentaeritritol al 35% p/v (15/4 EO/OH) y ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 100 mM ) pH 6,5. Para MtATPS forma 2, aparecieron cristales transparentes, largos pero delgados en forma de placa después de algunas semanas en las siguientes condiciones de cristalización: polietilenglicol 8000 al 20 % p/v, MES 100 mM pH 6,0 y acetato de calcio 200 mM.
Se mezcló MtAPSK (0,7 µl) a una concentración de 17,6 mg ml−1 con 0,7 µl de solución de depósito y se cocristalizó con MgCl2 2 mM. Cristales transparentes en forma de placa aparecieron después de algunas semanas en las siguientes condiciones de cristalización: polietilenglicol 3350 al 20% p/v y citrato trisódico 100 mM pH 5,5. MtAPSK también se cristalizó con MgCl2 2 mM y APS 2 mM pero las estructuras obtenidas de esos cristales fueron de menor resolución y sin ningún sustrato o producto presente en el sitio activo.
Se mezcló MtPAPSR (0,7 µl) a una concentración de 20 mg ml−1 con 0,7 µl de solución de depósito y se cocristalizó con FAD (concentración final de 0,5 mM). El cristal usado para la fase era un cuadrado marrón plano y apareció después de algunos días en las siguientes condiciones de cristalización: 40 % v/v de 2-metil-2,4-pentanodiol y 100 mM Tris/HCl pH 8,0.
El cristal utilizado para refinar a alta resolución era marrón con forma de placa alargada. Apareció después de algunos días en las siguientes condiciones de cristalización: 2-metil-2,4-pentanodiol al 35% v/v, Tris 100 mM pH 7,0 y NaCl 200 mM. Antes de la transferencia a N2 líquido, el cristal se sumergió en 3'-fosfoadenosina 5'-fosfato disódico 10 mM durante 7 min.
Se mezcló MtPAPP (0,7 µl) a una concentración de 20 mg ml−1 con 0,7 µl de solución de depósito y se cocristalizó con Tb-Xo4 (concentración final 10 mM), MnCl2 (concentración final 2 mM) y PAP 2 mM. El Tb-Xo4 es un agente de nucleación/fase50, que debería aumentar el rendimiento de la cristalización; sin embargo, en este caso, se obtuvo la misma forma cristalina en ausencia del compuesto y se difractó a una resolución similar. Aparecieron cristales bipiramidales transparentes después de algunas semanas en las siguientes condiciones de cristalización: citrato trisódico 1,6 M.
El manejo de los cristales de MtPAPSR se realizó dentro de la carpa Coy en atmósfera anaeróbica (N2:H2, 97:3); los demás cristales se manipularon en condiciones aeróbicas. Los cristales se sumergieron directamente en nitrógeno líquido o se empaparon durante 5 a 30 s en su solución de cristalización complementada con un crioprotector antes de congelarse en nitrógeno líquido. Para MtATPS forma 2, se usó glicerol al 30% como crioprotector. Para MtAPSK, se utilizó etilenglicol al 25% como crioprotector.
Los cristales se probaron y recolectaron a 100 K en diferentes sincrotrones (Tabla de datos extendida 1). Los datos se procesaron con autoPROC51 a excepción de MtPAPP, que proporcionó mejores estadísticas con la indexación mediante el X-ray Detector Software (XDS) y el paso de escalado realizado con SCALA52. Todas las estadísticas de recopilación de datos se proporcionan en la Tabla de datos extendida 1. Los formularios MtATPS 1 y 2, MtAPSK y MtPAPP se resolvieron utilizando PHENIX con las siguientes plantillas: 1V47 (ATPS de T. thermophilus) para el formulario MtATPS 1, formulario MtATPS 1 para el formulario MtATPS 2 y 5CB6 (APS quinasa de Synechocystis sp.) para MtAPSK. Para MtPAPP, la plantilla se creó de novo utilizando AlphaFold 2 (ref. 32).
Para MtPAPSR, se midió un espectro de fluorescencia de rayos X en el borde K de Fe para optimizar la recopilación de datos en la longitud de onda adecuada. Los conjuntos de datos se recopilaron a 1,73646 Å para el experimento de dispersión anómala de longitud de onda única. Los conjuntos de datos nativos se recopilaron a una longitud de onda de 0,97625 Å en otro cristal. Los datos fueron procesados y escalados con autoPROC51. El phasing, la modificación de la densidad y la construcción automática se realizaron con CRANK-2 (ref. 53).
Todos los modelos se reconstruyeron manualmente con COOT y se refinaron aún más con PHENIX54,55. Durante el refinamiento, se aplicaron simetría no cristalográfica y tornillo de traslación-libración. Para todas las estructuras excepto para ATPS forma 1, se agregaron hidrógenos en posición de conducción en el último ciclo de refinamiento. Se eliminaron los hidrógenos en los modelos depositados finales.
Todos los modelos se validaron utilizando MolProbity56. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos, así como los códigos de identificación PDB para los modelos depositados y los factores de estructura se enumeran en la Tabla 1 de datos ampliados. Las cifras se generaron con PyMOL (Schrödinger). El metal en MtATPS se modeló como zinc utilizando CheckMyMetal57.
Para visualizar los niveles de expresión de MtFsr cuando las células se cultivaron en diferentes fuentes de azufre, se realizó hrCN PAGE. Los cultivos de M. thermolithotrophicus (2 × 10 ml) se complementaron con Na2S 2 mM, Na2SO3 2 mM, Na2S 2 mM y Na2SO4 2 mM o Na2SO4 2 mM como sustratos de azufre y se cultivaron durante una noche a 65 °C, en reposo. Las células se recogieron mediante centrifugación anaeróbica a 6000 × g durante 20 min a temperatura ambiente y los sedimentos celulares se resuspendieron en 2 ml de tampón de lisis (tricina 50 mM, pH 8,0 y ditionito de sodio 2 mM). Las células se sonicaron 4 veces al 70 % de intensidad durante 10 s, seguido de un descanso de 30 s (sonda MS 73, SONOPULS Bandelin). El PAGE de hrCN se ejecutó de forma anaeróbica y el protocolo se detalla en Datos extendidos bajo la preparación del PAGE de hrCN. Se corrió un gel con un gradiente de acrilamida del 8 al 15 % (que se muestra en la Fig. 5b) y otro con un gradiente de acrilamida del 5 al 15 % (ver Datos de origen, Fig. 5).
La actividad de ambas enzimas estuvo determinada por la producción de ADP que se acopló a la oxidación de NADH vía piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa58. Los ensayos se realizaron en un volumen final de 100 µl de placas de pocillos profundos de 96 pocillos y se controlaron espectrofotométricamente (lector de microplacas multimodo Omega) a 360 nm a 35 °C. Se utilizó como tampón KH2PO4 (100 mM) a pH 7,0, complementado con MgCl2 1,5 mM y KCl 100 mM. Para NADH, se determinó experimentalmente un coeficiente de extinción molar de 4.546,7 cm−1 M−1 para las condiciones mencionadas anteriormente. Al tampón, NADH 1 mM, Na2SO4 2,5 mM, fosfoenolpiruvato (PEP) 1 mM, ATP 2 mM, pirofosfatasa inorgánica 2 U (Saccharomyces cerevisiae, 10108987001, Sigma-Aldrich), lactato deshidrogenasa 1,1 U ml−1, 0,8 U ml− Se añadieron 1 piruvato quinasa (músculo de conejo, P0294, Sigma-Aldrich) y 0,5 mg ml-1 MtAPSK (todas las concentraciones finales). La reacción se inició mediante la adición de 0,5 mg ml-1 MtATPS. La adición de Na2MoO4 0,02 mM no afectó la actividad (0,116 ± 0,027 µmol de NADH oxidado min−1 mg−1), pero la adición de Na2MoO4 2 mM resultó en una disminución (0,068 ± 0,019 µmol de NADH oxidado min−1 mg−1 ). Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
La actividad de la MtPAPP se determinó mediante la producción de ortofosfato, que se cuantificó utilizando el kit de ensayo de fosfato verde de malaquita (Sigma-Aldrich) mediante la formación de un complejo verde. Los ensayos se realizaron en placas de pocillos profundos de 96 pocillos y se siguió espectrofotométricamente la absorbancia a 620 nm (lector de microplacas multimodo Omega). Se usó Tris/HCl (25 mM) a pH 7,64 como tampón. Tampón, PAP 40 µM o AMP/ADP/ATP/APS o PPi 90 µM, 1 mg ml−1 de albúmina de suero bovino, MnCl2 50 µM y/o MgCl2 50 µM (concentración final) se mezclaron en un tubo Eppendorf de 1,5 ml en hielo. Se añadió MtPAPP previamente congelado (0,5 µg ml−1 de concentración final) y la mezcla (volumen final de 40 µl) se incubó inmediatamente durante 5 min a 40 °C. A continuación, se diluyeron 14 µl de la mezcla de reacción en 66 µl de Milli-Q H2O filtrada y se congelaron inmediatamente en N2 líquido para extinguir la reacción. Luego, se añadieron a las muestras 20 µl de reactivo verde de malaquita, la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 min y se midió la formación del complejo verde a 620 nm. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Las medidas presentadas en la Fig. 3a provienen de dos experimentos diferentes (paneles secundarios izquierdo y derecho). Ambos experimentos se realizaron en dos días diferentes con la misma preparación enzimática.
Dado que PAPS es inestable a altas temperaturas, primero intentamos determinar la actividad de MtPAPSR en la dirección de la producción de PAPS, como se describió anteriormente para las APS reductasas disímiles para la producción de APS38. La oxidación de PAPS se determinó en tampón Tris/HCl 50 mM (pH 7,5) que contenía Na2SO3 5 mM, PAP 2 mM o AMP 2 mM (concentraciones finales) y 3,27 µg ml−1 MtPAPSR. La reacción se inició con una concentración final de K3Fe(CN)6 0,5 mM. Se midió la disminución de la absorbancia a 420 nm y se corrigió para la reacción de fondo sin enzima. No se detectó actividad. Por lo tanto, usamos la reacción fisiológica para monitorear la actividad de MtPAPSR. Para realizar el ensayo MtPAPSR acoplado, las enzimas debían purificarse al mismo tiempo y usarse inmediatamente para el ensayo (consulte Materiales complementarios para conocer el protocolo de purificación detallado de las enzimas utilizadas en este ensayo).
Los ensayos de actividad de MtPAPSR se llevaron a cabo en una atmósfera anaeróbica (100% N2) a 45 °C. Los ensayos se realizaron en un volumen final de 200 µl en placas de pocillos profundos de 96 pocillos y se controlaron espectrofotométricamente en un lector de microplacas SPECTROstar Nano. Se utilizó como tampón HEPES (50 mM, pH 7,0) suplementado con KCl 50 mM, MnCl2 1,5 mM y MgCl2 1,5 mM. El metil viológeno reducido (MVred, 0,5 mM) sirvió como donante de electrones para MtPAPSR. El coeficiente de extinción molar (ε600nm = 8.133,3 cm−1 M−1) se determinó experimentalmente utilizando las condiciones mencionadas anteriormente y reduciendo el metil viológeno con ditionito de sodio 2 mM. Para el ensayo, se redujo el metil viológeno con monóxido de carbono mediante la CO-deshidrogenasa de Clostridium autoethanogenum de acuerdo con un protocolo publicado previamente59. El CO se intercambió por N2 y el MVred se usó inmediatamente para el ensayo. Al tampón y MVred, ATP 5 mM, ditionito de sodio 1 mM, 0,2 U de pirofosfatasa (E. coli, MFCD00131379, Sigma-Aldrich), 0,127 mg ml−1 MtATPS, 0,12 mg ml−1 MtAPSK, 0,1 mg ml−1 MtPAPP y se añadieron 0,0645 mg ml-1 MtPAPSR. La reacción se inició con la adición de Na2SO4 5 mM y se siguió con la oxidación de MVred a 600 nm. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Para determinar la actividad de sulfito reductasa de M. thermolithotrophicus, los cultivos se cultivaron en Na2S 2 mM, Na2SO3 2 mM o Na2SO4 en 10 ml del medio mencionado anteriormente en matraces de suero. Las células (9 ml) se recogieron en fase exponencial tardía (OD600: 3,45 para Na2S 2 mM, 3,91 para Na2SO3 2 mM, 3,37 para Na2SO4) mediante centrifugación a 6000 × g durante 10 min a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y se congelaron los sedimentos celulares en N2 líquido. A continuación, los sedimentos se resuspendieron en 1 ml de KH2PO4 0,5 M, pH 7,0. Las células se lisaron mediante sonicación (2 × 10 s al 50 % de intensidad, sonda MS73, SONOPULS Bandelin), seguido de centrifugación a 4 °C a 15 600 × g. El sobrenadante se pasó por un filtro de 0,2 µm y se determinó la concentración de proteína por el método de Bradford (6,63 mg ml−1 para Na2S 2 mM, 6,14 mg ml−1 para Na2SO3 2 mM y 6,31 mg ml−1 para Na2SO4). Los ensayos de actividad se realizaron en atmósfera anaeróbica (100 % N2) a 50 °C en placas de pocillos profundos de 96 pocillos y se controlaron espectrofotométricamente (lector de microplacas SPECTROstar Nano). La mezcla de ensayo contenía KH2PO4 0,5 M pH 7,0, MVred 118 µM (concentración final, previamente reducida con la cantidad equimolar de ditionito de sodio) y Na2SO3 30 µM (concentración final). Bajo estas condiciones, se determinó experimentalmente un coeficiente de extinción molar de ε600nm = 9,840 cm−1 M−1. La reacción se inició mediante la adición de 0,05 µg de extracto celular, seguido de oxidación de MVred a 600 nm. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Para obtener una descripción detallada del análisis filogenético, consulte Materiales complementarios60.
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.
Todas las estructuras utilizadas para la comparación estructural son accesibles desde el Protein Data Bank y, en consecuencia, se citan en el texto. Las estructuras se depositaron en el Protein Data Bank con el ID: 8A8G para MtATPS forma 1, 8A8D para MtATPS forma 2, 8A8H para MtAPSK, 8A8K para MtPAPP y 8A8O para MtPAPSR. Los datos para este estudio están disponibles en el documento y su información complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento.
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Damos las gracias al Instituto Max Planck de Microbiología Marina y la Sociedad Max Planck de apoyo continuo; el sincrotrón SOLEIL para la asignación de tiempo de haz y el personal de línea de haz de Proxima-1 para ayudar con la recopilación de datos; el personal de la línea de luz X06DA de SLS y P11 en PETRA III; DR Dean por proporcionarnos el plásmido RE pDB1281; C. Probian y R. Appel por el apoyo continuo en el laboratorio de Metabolismo Microbiano y cultivo de Archaeoglobus fulgidus; G. Wegener y M. Alisch del HGF MPG Joint Research Group for Deep-Sea Ecology and Technology por su ayuda con las mediciones de cromatografía iónica; U. Ermler, J. Fritz-Steuber y G. Fritz por sus excelentes debates y comentarios críticos sobre el manuscrito. Esta investigación fue financiada por Max-Planck Gesellschaft y la fundación Novo Nordisk (NNF21OC0070790, TW). MJ fue apoyado por el Deutsche Forschungsgemeinschaft Schwerpunktprogram 1927 "Iron-sulfur for Life" (WA 4053/1-1, MJ).
Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Sociedad Max Planck.
Grupo de Metabolismo Microbiano, Instituto Max Planck de Microbiología Marina, Bremen, Alemania
Marion Jespersen y Tristán Wagner
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MJ cultivó los metanógenos, purificó y cristalizó todas las proteínas descritas en este estudio. MJ realizó toda la caracterización bioquímica. MJ y TW recopilaron datos de rayos X y resolvieron las estructuras. MJ y TW refinaron y validaron todos los modelos. TW y MJ diseñaron la investigación y escribieron el artículo.
Correspondencia a Tristán Wagner.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Nature Microbiology agradece a M. Elizabeth Stroupe y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.
Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.
\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-reducción asimilatoria. (Ruta 1a, 1b, 1c) \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) es activado por la ATP-sulfurilasa (por ejemplo, Glycine max, PDB: 4MAF) a APS. (1a) APS se reduce directamente a sulfito (\({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\)) y AMP por un grupo [4Fe-4S] que contiene APS-reductasa ( por ejemplo Pseudomonas aeruginosa, PDB: 2GOY, dependiente de tiorredoxina). (1b, c) Alternativamente, el APS se fosforila aún más por una APS-quinasa (por ejemplo, Arabidopsis thaliana, PDB: 3UIE) para producir PAPS. (1b) Una PAPS-reductasa (Saccharomyces cerevisiae, PDB: 2OQ2, dependiente de tiorredoxina) convierte PAPS en \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) y PAP. El PAP se hidrolizará a fosfato inorgánico (Pi) y AMP por una PAP-fosfatasa (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis, PDB: 5DJJ). (1a, b) Una sulfito-reductasa (Escherichia coli, PDB: 1AOP) reduce el \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) en S2−, que luego se puede incorporar en biomasa. En la ruta 1c, una sulfotransferasa (por ejemplo A. thaliana, PDB: 5MEK) cataliza la transferencia del grupo sulfo (R-OSO3−) de PAPS a un aceptor de alcohol o amina. \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-reducción disimilatoria. \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) es activado por ATPS a APS y reducido aún más a \({{\rm{SO}}}_{3}^{ 2-}\) por una APS-reductasa (por ejemplo, Archaeoglobus fulgidus, PDB: 2FJA), que contiene dos grupos [4Fe-4S] y un FAD. Una sulfito-reductasa (por ejemplo, A. fulgidus, PDB: 3MM5) reduce el \({{\rm{SO}}}_{3}^{2-}\) y lo ramifica en el portador DsrC. El complejo de membrana DsrMKJOP (por ejemplo, Allochromatium vinosum) reduce el azufre a HS− junto con la translocación de iones para la conservación de energía. Los sirohemes, FAD y [4Fe-4S]-clusters están representados en palos y esferas, con carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre y hierro coloreados en rosa, rojo, azul, amarillo y naranja. Las enzimas se muestran en caricatura y superficie transparente en su estado oligomérico. El ATPS de A. fulgidus se modeló utilizando Alphafold232 y se coloreó en verde. La ATP-sulfurilasa CysDN bifuncional que utiliza un GTP adicional no se presentó aquí para simplificar el esquema.
a, \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) tolerancia de M. thermolithotrophicus. El archaeon se cultivó en \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) (cuadrado gris), \({{\rm{SO}}}_{4}^{2 -}\) complementado con una cantidad equimolar de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) (cuadrado de trigo) y \({{\rm{SO}}}_{ 4}^{2-}\) complementado con un exceso de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) (cuadrado rojo oscuro). Como control, se utilizaron cultivos cultivados con Na2S (S2-, triángulo negro) y cultivos cultivados con Na2S con un exceso de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) (triángulo rojo) . Este experimento de crecimiento se realizó por duplicado. b, Efecto de las razones \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) en cultivos de M. thermolithotrophicus cultivados en Na2SO4 0,5 mM. Los cuadrados grises indican la curva de crecimiento de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\)-reductores sin la adición de \({{\rm{MoO}}}_{4}^ {2-}\). Los cuadrados rojos indican la curva de crecimiento de los reductores \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) expuestos a 5 mM de \({{\rm{MoO}}}_{4 }^{2-}\), seguido de la adición de Na2SO4 25 mM. Las flechas discontinuas negras indican la hora de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\) y \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-} \) suma. Este experimento de crecimiento se realizó por triplicado. c, sensibilidad de Archaeoglobus fulgidus hacia \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\). Aquí, una proporción de \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) de 0,001:1 es suficiente para inhibir el crecimiento de A. fulgidus. Los datos que se muestran son cuadruplicados excepto por el menor y el mayor \({{\rm{MoO}}}_{4}^{2-}\):\({{\rm{SO}}}_{4} ^{2-}\), que se realizaron por triplicado. Todos los experimentos se representan como media de datos y para b, c ± desviación estándar (sd).
Datos fuente
a, Comparación de ATPS en representación de superficie, coloreada por la composición del dominio I (amarillo), II (verde claro), III (trigo) y APS quinasa (naranja oscuro). Las superficies grises corresponden al monómero opuesto. ScATPS se organiza como homohexámero. b, los monómeros de MtATPS (amarillo), TtATPS (gris), ScATPS (azul marino), RrsATPS (magenta), GmATPS (verde) y AaATPS (cian) se superponen en el dominio II y se muestran como dibujos animados. Las abreviaturas y rmsd se pueden encontrar en la Tabla complementaria 1. c, d, Área de superficie involucrada en la oligomerización de MtATPS (c) y TtATPS (d). Un monómero se muestra en representación de superficie y un monómero se muestra en dibujos animados. Los contactos monómero-monómero, establecidos por el dominio III de una cadena (en naranja para MtATPS y en negro para TtATPS), se muestran como una superficie roja. La superficie de color trigo resalta el dominio III. La entrada enmarcada es un primer plano del motivo de unión de Zn y los residuos que coordinan el Zn se dibujan como barras. El carbono, el nitrógeno y el azufre están coloreados como naranja/blanco, azul y amarillo, respectivamente. e,f, sitio catalítico de MtATPS (apo, e) y TtATPS con APS unido (f). Los elementos están coloreados como en las entradas (c, d) con oxígeno y fósforo en rojo y naranja, respectivamente. Los residuos pertenecientes a los motivos canónicos del ATPS están resaltados por átomos de carbono de color rosa.
a, La sulfato adenililtransferasa heterodimérica (CysDN) con la sulfurilasa dependiente de ATP homo-oligomérica (sat) yb, APS-quinasas. Para el panel a: la ATP-sulfurilasa asimilatoria heterodimérica está compuesta por una subunidad CysN de GTPasa reguladora (rojo claro) y una subunidad catalítica CysD (azul). Sat está involucrado en la reducción de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) tanto asimilatoria como disimilatoria (naranja claro). MtATPS y MtAPSK están resaltados en rojo negrita. Los valores de soporte de Bootstrap ≥90 % se muestran como puntos en los nodos interiores.
a, panel izquierdo, homodimérico MtAPSK apo (naranja) superpuesto a su homólogo más cercano, Synechocystis sp. PCC 6803 (SsAPSK, blanco, PDB: 5CB6) en complejo con APS y AMP-PnP. Los ligandos se muestran en palos y esferas y la parte faltante 125-152 en MtAPSK (indicada por bolas) se resalta en negro en SsAPSK. El carbono, el nitrógeno, el oxígeno, el azufre y el fósforo están coloreados en naranja claro/blanco/cian, azul, rojo, amarillo y naranja, respectivamente. Panel derecho: superposición de MtAPSK (trigo), AtAPSK (naranja, PDB: 3UIE), ApAPSK (pizarra, PDB: 2YVU) y PcAPSK (blanco, PDB: 1M7H) en un monómero y se muestra en dibujos animados. La posición del sitio activo se indica con una flecha negra. Las abreviaturas y rmsd se pueden encontrar en la Tabla complementaria 2. b, c, sitio catalítico de apo MtAPSK (b) y SsAPSK unido a APS y AMP-PnP (c). Los elementos están coloreados como en (a), panel izquierdo. En (b), las flechas indican la parte faltante 125–152.
a, conservación de plegamiento a través de MtPAPP, la nanoRNasa A de Bacillus subtilis (BsNrnA, PDB: 5IUF) y la recombinasa RecJ de Deinococcus radiodurans (DrRecJ, PDB: 5F55). Para BsNrnA y DrRecJ, las estructuras solo representan los dominios DHH y DHHA1 y los motivos de la estructura secundaria se vuelven a numerar para simplificar la comparación con MtPAPP. b, Diferencias en la unión de nucleótidos entre MtPAPP, NanoRNasa A y la recombinasa RecJ con los residuos de superficie interactuando con el ligando coloreado en verde. c, Primer plano de la coordinación Mn2+ entre MtPAPP, BsNrnA (PDB: 5IZO) y DrRecJ (PDB: 5F55). Mn2+ se muestran como esferas violetas y los residuos que las coordinan se resaltan como palos y bolas. Los átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno y fósforo están coloreados respectivamente en verde/gris, azul, rojo y naranja. Los residuos que pertenecen al motivo DHH canónico tienen átomos de carbono de color rosa. La estructura utilizada para BsNrnA es la variante His103Ala y la cadena lateral de His160 no se ha modelado en la estructura DrRecJ.
a, PAP-fosfatasas con oligorribonucleasas bifuncionales y PAP-fosfatasas, así como exonucleasas (RecJ), yb, APS-reductasas disimilatorias (subunidad α) y (supuestas) APS/PAPS-reductasas asimilatorias. MtPAPSR y MtPAPP están resaltados en rojo negrita. Los valores de soporte de Bootstrap ≥90 % se muestran como puntos en los nodos interiores. Los asteriscos (*) delante de las secuencias de Methanocaldococcus jannaschii resaltan las dos enzimas previamente caracterizadas bioquímicamente.
a, Esquema del ensayo de enzima acoplada utilizado para medir la actividad de MtPAPSR mediante la oxidación de metil viológeno reducido (MVred) a 600 nm en una atmósfera de N2 y a 45 °C. Las enzimas se expresaron de forma recombinante en E.coli, excepto la pirofosfatasa, que se obtuvo comercialmente. La mezcla de reacción contenía todas las enzimas, metales (Mn2+, Mg2+), tampón HEPES a pH 7,0 y los sustratos \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\) y ATP. La reacción se inició con la adición de \({{\rm{SO}}}_{4}^{2-}\). b, c, 'Blanco' corresponde a una solución que contiene el tampón, los sustratos, MVred y ditionito pero no enzimas. 'Todos los componentes' contenían todos los compuestos mostrados en el esquema (a). b, especificidad de sustrato de MtPAPSR. 'No MtAPSK' corresponde a todos los componentes excepto MtAPSK, que impidió la generación de PAPS a partir de APS. Con APS como sustrato se midió una actividad enzimática específica de 0.007 ± 0.001 µmol de MV.min−1.mg−1 oxidado de PAPSR, que es solo el 6.54 % de la actividad con el APSK (corresponde a la Fig. 4a, + APS-ATPS-APSK). La diferencia se puede atribuir a una inestabilidad del APS añadido. c, Impacto de diferentes concentraciones de MtPAPSR en la actividad: una adición quíntuple de MtPAPSR resultó en una estimulación de la tasa de oxidación de MV en un 220 % (mostrado en cuadrados de color verde oscuro, '5 veces más MtPAPSR'). Después de 30 minutos, la adición quíntuple de MtPAPS-reductasa condujo a la agregación, razón por la cual la DO600nm comenzó a aumentar después de este punto de tiempo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se representaron como media de datos ± sd
Datos fuente
Todas las estructuras se muestran en dibujos animados con sus cofactores (metalo) en bolas y palos. Los primeros planos de los sitios activos (a la derecha) con residuos importantes para la unión del sustrato se destacan como bolas y palos. La APS-reductasa disimilatoria de Archaeoglobus fulgidus es un heterotetrámero compuesto por dos subunidades (αβ). Cada subunidad β contiene dos grupos [4Fe-4S] y cada subunidad α un FAD. El APSR asimilatorio presentado de Pseudomonas aeruginosa es un homotetrámero. Contiene un grupo [4Fe-4S] por monómero. El PAPSR asimilatorio de Saccharomyces cerevisiae es homodimérico. Los elementos oxígeno, nitrógeno, fósforo, azufre y hierro son de color rojo, azul, naranja, amarillo y marrón, respectivamente. El carbón del sustrato/producto está coloreado en cian, y en amarillo para el FAD. Los residuos catalíticos se destacan con etiquetas rojas.
Figs suplementarias. 1–8, Tablas 1 y 2, Construcciones y optimización de codones de genes, y Discusión.
Archivo de materiales complementarios.
Fuente de datos estadísticos para la figura complementaria 2.
Fuente de datos estadísticos.
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Fuente de datos estadísticos.
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Geles nativos sin procesar.
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Reimpresiones y permisos
Jespersen, M., Wagner, T. Reducción asimilatoria de sulfato en el metanógeno marino Methanothermococcus thermolithotrophicus. Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01398-8
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Recibido: 28 febrero 2023
Aceptado: 26 abril 2023
Publicado: 05 junio 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01398-8
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