Generación de Gαi knock | Grupo de forjas de Shandong

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 112 (2023) Citar este artículo

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Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) son proteínas fundamentales de la membrana celular que detectan moléculas extracelulares y activan respuestas celulares. La familia de la subunidad i α de la proteína G (Gαi) representa el compañero de acoplamiento de GPCR más común y consta de ocho subunidades con distintas propiedades de señalización. Sin embargo, analizar el patrón de acoplamiento ha sido un desafío debido a la expresión endógena de las subunidades Gαi en prácticamente todas las líneas celulares. Aquí, generamos una línea celular HEK293 que carece de todas las subunidades Gαi, lo que permite la medición del acoplamiento GPCR-Gαi tras la reexpresión transitoria de una subunidad Gαi específica. Perfilamos la selectividad de acoplamiento de Gαi en 11 GPCR midiendo la actividad inhibitoria inducida por ligando para la acumulación de AMPc. Luego, los perfiles de acoplamiento se clasifican en tres grupos, que representan aquellos acoplados preferentemente a Gαz, aquellos a Gαo y aquellos con selectividad no aparente. Estos resultados indican que los GPCR acoplados a Gαi individuales afinan la señalización de Gαi ejerciendo una preferencia de acoplamiento en el nivel de la subunidad Gαi.

Los receptores acoplados a proteína G (GPCR), los transductores clave que vinculan los estímulos extracelulares con las señales intracelulares posteriores, son los objetivos más comunes para el desarrollo de fármacos1. Tras la unión del ligando de GPCR, las proteínas heteroméricas de unión a nucleótidos de guanina (proteínas G), que consisten en subunidades α, β y γ, inducen la activación de sus proteínas efectoras. Entre las tres subunidades, la subunidad α determina principalmente las propiedades clave de las proteínas G heterotriméricas individuales. El genoma humano codifica 16 subunidades α, que se agrupan en cuatro subfamilias según su homología de secuencia y similitud funcional, a saber, Gαs, Gαi, Gαq y Gα122. La subfamilia Gαi es el compañero de acoplamiento más común en la familia A GPCR3,4. Además, aproximadamente el 45 % de los GPCR a los que se dirigen los fármacos aprobados por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) se acoplan a la subfamilia Gαi5, lo que destaca la importancia de los GPCR acoplados a Gαi como objetivos farmacológicos.

Estudios previos han demostrado que las subunidades Gαi tienen funciones superpuestas y distintas. La subfamilia Gαi consta de ocho subunidades α: Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαt1, Gαt2, Gαt3, Gαo y Gαz. La activación del heterotrímero Gi induce diversos procesos de señalización celular, como la inhibición de la adenilil ciclasa y los canales de calcio, y la activación de los canales de potasio6. A pesar de la alta homología de secuencia dentro de la subfamilia Gαi, se han informado varias funciones específicas de la subunidad. Por ejemplo, la transducina (Gαt1 y Gαt2) y la gustducina (Gαt3) están implicadas en la percepción visual y gustativa, respectivamente, ambas activando la fosfodiesterasa cGMP7,8. Además, mediante experimentos de reducción de la subunidad Gαi en células GH4C1, se descubrió que Gαo y Gαi2 median la inhibición de la entrada de calcio y la acumulación de AMPc, respectivamente9. Las subunidades Gαi también se comportan bioquímicamente diferentes entre sí. Cabe señalar, sin embargo, que estas propiedades bioquímicas podrían modificarse en células vivas como se observa en Gq, que muestra una disociación de nucleótidos más lenta en estado purificado que en estado de membrana lipídica. Por ejemplo, la tasa de disociación espontánea de GDP de Gαo es un orden de magnitud más rápida que la de Gαi1-310, y la actividad GTPasa intrínseca de Gαz es 200 veces más lenta que la de las otras subunidades de Gαi11. Estas diferencias entre los miembros de la familia Gαi permiten diversas transducciones de señales GPCR acopladas a Gαi.

Aunque las propiedades de señalización de las subunidades Gαi se han caracterizado bien, la selectividad de acoplamiento de la subunidad Gαi de los GPCR solo se ha investigado para un número limitado de receptores debido a dificultades experimentales. El acoplamiento GPCR-Gαi individual no puede evaluarse simplemente expresando una subunidad Gαi de interés porque prácticamente todas las células de mamíferos expresan endógenamente múltiples subunidades Gαi12. Para eliminar el acoplamiento GPCR-Gαi endógeno, estudios previos han utilizado la toxina pertussis (PTX), que ribosila con ADP el residuo de cisteína en la cola C-terminal de las subunidades Gαi13. Al expresar un mutante Gαi resistente a PTX con una sustitución en el residuo de cisteína, el tratamiento con PTX permite medir el acoplamiento selectivo de la subunidad Gαi mutante14,15,16. Sin embargo, la alteración del residuo de cisteína puede afectar la capacidad de acoplamiento de la proteína G de las subunidades α17,18. Además, PTX no inhibe a Gαz ya que tiene isoleucina en el sitio de direccionamiento de PTX19. Recientemente, se han utilizado técnicas basadas en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o bioluminiscencia para evaluar el acoplamiento de subunidades Gα individuales modificadas20,21. Sin embargo, estos métodos requieren la inserción de luciferasa o una proteína fluorescente en la subunidad α, y dicha modificación afecta sus propiedades bioquímicas y la eficiencia de acoplamiento resultante22.

En este estudio, evitamos las dificultades experimentales para medir las subunidades Gαi intactas individuales mediante el empleo de enfoques de edición del genoma para establecer un fondo nulo de Gαi en células 293A de riñón embrionario humano (HEK). Al expresar transitoriamente un par de GPCR y una subunidad Gαi de interés en las células HEK293A deficientes en Gαi, caracterizamos con éxito los perfiles de acoplamiento de Gαi en 11 GPCR y encontramos una selectividad fisiológicamente razonable de las subunidades Gαi para estos GPCR.

Con el fin de establecer un fondo nulo de Gαi para el análisis funcional de los patrones de acoplamiento de subunidades de Gαi, generamos una línea celular HEK293A desprovista de todas las subunidades de Gαi. Primero, medimos la expresión de las subunidades Gαi en células HEK293A mediante análisis cuantitativo de RT-PCR. Si bien se expresaron siete genes que codifican la subunidad Gαi (GNAI1, GNAI2, GNAI3, GNAO1, GNAT1, GNAT2 y GNAZ), la expresión de GNAT3 fue indetectable (Fig. 1a). Para validar el par de cebadores de PCR para GNAT3, medimos y confirmamos la expresión de GNAT3 en una muestra de tejido del intestino delgado, en la que se sabe que se expresa GNAT323 (Fig. 1 complementaria). A continuación, nos dirigimos a los siete genes que codifican la subunidad Gαi presentes en las células HEK293A mediante la mutagénesis CRISPR-Cas9 de tres rondas (Fig. 1b). Diseñamos ARN de guía única (sgRNA) para inducir la escisión del ADN de doble cadena dentro de la mitad N-terminal de cada subunidad α. Tras la introducción exitosa de mutaciones sin sentido o de cambio de marco por parte de estos sgRNA, se espera que los genes mutados produzcan subunidades Gαi truncadas con la eliminación de la hélice α5 c-terminal, que es responsable del acoplamiento del receptor24. Después de la transfección de las construcciones de sgRNA, la clasificación de células activadas por fluorescencia, el aislamiento de las células positivas para GFP y la expansión de las colonias de células clonales, los clones se examinaron en busca de mutaciones en los genes diana utilizando el método de enzimas de restricción, obteniendo un clon knock-out. candidato (células ΔGαi) (Fig. 1c). La secuenciación de Sanger de las regiones genómicas objetivo confirmó que las células ΔGαi portan mutaciones de cambio de marco o inserciones grandes, incluidos los codones de parada, en todos los alelos objetivo (Fig. 2 complementaria). La expresión de GNAT3 no se detectó en las células ΔGαi (Fig. 1 complementaria). Estos resultados indican que los siete genes que codifican la subunidad Gαi se mutaron con éxito en las células HEK293A para evitar su expresión endógena.

a Análisis de PCR cuantitativo en tiempo real de las subunidades Gαi en las células originales HEK293A. Las barras y las barras de error representan la media y el error estándar de la media (SEM), respectivamente, de tres experimentos independientes. Cada experimento se realizó por duplicado. Abreviatura: ND, no detectado. b Estrategia para la inactivación genética de los miembros de la familia Gαi. Las células ∆Gαi se obtuvieron mediante mutagénesis CRISPR-Cas9 de tres rondas. c Identificación del genotipo del clon mutante Gαi utilizando el método de fragmentos digeridos con enzimas de restricción. Los objetivos de sgRNA se amplificaron mediante PCR y se trataron con sus correspondientes enzimas de restricción (RE). Las muestras digeridas se sometieron a análisis de electrografía capilar y se visualizaron imágenes de pseudogel del electroferograma con un marcador de ADN de la digestión de pUC19/Hpa II. Las puntas de flecha negras y rojas indican fragmentos de PCR no digeridos y digeridos con RE del sitio objetivo, respectivamente. Tenga en cuenta que hay dos sitios RE en los fragmentos de PCR de los genes GNAI2 y GNAT1, y RE podría digerir uno de los alelos mutados en el gen GNAI1. Abreviaturas: P parental, KO knock-out.

A continuación, examinamos funcionalmente la falta de subunidades Gαi en células ΔGαi utilizando un ensayo GloSensor cAMP. Expresamos el receptor opioide µ (MOR), un receptor acoplado a Gαi prototípico, junto con el indicador de AMPc GloSensor y medimos los niveles de AMPc tras la estimulación con el ligando, metionina-encefalina (MetEnk), junto con forskolina. En las células madre, la acumulación de cAMP estimulada por forskolina se inhibió casi por completo de una manera dependiente de la concentración de MetEnk (Fig. 2a). Por el contrario, las células ∆Gαi no respondieron por completo a MetEnk, mientras que la expresión exógena de Gαi2 restauró su respuesta al ligando (Fig. 2b). Estos resultados muestran que las células ΔGαi carecen de subunidades Gαi funcionales, lo que las hace adecuadas para investigar la señalización de la subunidad Gαi.

a, b Curvas de concentración-respuesta del ensayo GloSensor cAMP en células originales (a) y ∆Gαi (b). Las células madre y ∆Gαi que expresaban transitoriamente el reportero Glo-22F cAMP con MOR y Gαi2 se estimularon con forskolina 10 µM junto con las concentraciones indicadas de MetEnk. Para cada experimento, la acumulación de AMPc inducida por forskolina se fijó en 100%. En ambas figuras, los símbolos y las barras de error representan la media y SEM, respectivamente, de tres experimentos independientes. Cada experimento se realizó por triplicado. Tenga en cuenta que para muchos puntos de datos, las barras de error son más pequeñas que el tamaño de los símbolos y, por lo tanto, no son visibles.

Para caracterizar aún más las células ∆Gαi, comparamos la proliferación celular de las células madre y ∆Gαi. Evaluamos la proliferación celular recolectando las células 48 h después de la siembra y contando el número de células. La proliferación celular de las células ∆Gαi en 48 h se redujo en un 20% en comparación con la de las células originales (Fig. 3 complementaria). Al igual que las células ∆Gαi, las células originales tratadas con PTX también mostraron una reducción del 20 % en la proliferación celular en comparación con las células originales no tratadas. Este resultado sugiere que la supresión de la proliferación celular en las células ∆Gαi no se debe a un efecto clonal sino a la deficiencia en el objetivo de las proteínas Gαi. Además, la proliferación reducida en las células ∆Gαi y las células progenitoras tratadas con PTX se recuperaron cultivando las células en placas recubiertas de colágeno tipo I (Fig. 3 complementaria), lo que sugiere que la supresión de la proliferación celular se debe al debilitamiento adhesión de las células ∆Gαi.

Para examinar si la otra señalización de proteína G se vería afectada en las células ΔGαi, se evaluaron individualmente las señales de Gs, Gq y G12. Expresamos el receptor V2 de vasopresina acoplado a Gs (V2R) o el receptor D1 de dopamina (D1R) junto con el reportero GloSensor cAMP tanto en las células ΔGαi como en las células parentales. A continuación, las células se estimularon con sus agonistas o con forskolina y se midió su acumulación de AMPc. La señalización de Gs en las células ΔGαi se mejoró en comparación con la de las células originales (Fig. 3a, b). A continuación, medimos la señalización de Gq y G12 a través del ensayo de desprendimiento de factor de crecimiento transformante (TGF) α25 usando GPCR acoplados con Gq- (H1R y α1A) o G12- (EP3 y CB1). Mediante el uso de células deficientes en proteína G, hemos validado previamente que las respuestas de desprendimiento de TGFα inducidas por el Gq-GPCR probado (H1R y α1A) y el G12-GPCR probado (CB1 y EP3) dependían únicamente de Gq/11 y G12/ 13, respectivamente3. Cada GPCR se expresó junto con un indicador de TGFα (AP-TGFα) marcado con fosfatasa alcalina en las células ∆Gαi y las células progenitoras, y posteriormente se midió su respuesta de desprendimiento de ectodominio AP-TGFα inducida por ligando. La señalización de Gq y G12 en las células ΔGαi fue comparable a la de las células originales (Fig. 3c-f). Estos datos demuestran que la eliminación de las subunidades Gαi no afecta la señalización de Gq y G12 pero sí potencia la señalización de Gs, posiblemente debido a la pérdida de competencia en las adenilil ciclasas entre Gs y Gi.

a, b Curvas de concentración-respuesta de la acumulación de AMPc mediada por Gs. Las células madre y ∆Gαi que expresaban transitoriamente Glo-22F junto con D1R (a) o V2R (b) se estimularon con las concentraciones indicadas de dopamina o arginina vasopresina (AVP), respectivamente. c – f Curva de concentración-respuesta de las respuestas de eliminación de TGFα inducidas por Gq- (H1R (c) y α1A (d)) y la activación del receptor acoplado a G12 (CB1 (e) y EP3 (f)) en el padre y el ∆Gαi células. Se expresó un GPCR de prueba en las células parentales y ∆Gαi junto con el indicador AP-TGFα, y se evaluó la respuesta inducida por el ligando resultante. En todas las figuras, los símbolos y las barras de error representan la media y SEM, respectivamente, de tres experimentos independientes. Cada experimento se realizó por triplicado. Tenga en cuenta que para muchos puntos de datos, las barras de error son más pequeñas que el tamaño de los símbolos y, por lo tanto, no son visibles.

Además, examinamos si los GPCR acoplados a Gi obtienen acceso a otras proteínas Gα en ausencia de proteínas Gαi usando MOR como ejemplo. Como se muestra en la Fig. 2b, la activación de MOR no aumentó el cAMP en las células ∆Gαi, lo que demuestra que no se acopla a Gs incluso en ausencia de Gαi. Examinamos además si MOR se acopla a Gq y G12 en la condición de deficiencia de Gαi usando el ensayo de desprendimiento de TGFα. Descubrimos que MOR no mostró una respuesta detectable de eliminación de TGFα tanto en las células parentales como en las células ∆Gαi (Fig. 4 complementaria), lo que indica que MOR no se acopla con Gq y G12 incluso en ausencia de proteínas Gαi. Es de destacar que validamos la activación de MOR en el ensayo de eliminación de TGFα mediante el uso de la proteína Gα quimérica Gαq/i1, que se une a los GPCR acoplados a Gi y transduce la señalización de Gq, como control positivo (Fig. 4 complementaria). Si bien estos datos respaldan que MOR no se acopla a Gα no preferido incluso en ausencia de Gα preferido, no podemos excluir la posibilidad de que otros GPCR acoplados a Gi se comporten de manera diferente. Por lo tanto, se recomienda considerar esta posibilidad al analizar el acoplamiento de proteína G utilizando células deficientes en Gα.

Evaluamos los perfiles de acoplamiento de GPCR-Gαi expresando un par de subunidades de GPCR y Gαi de interés en las células ∆Gαi. Elegimos cinco subunidades Gαi, a saber, Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαo y Gαz, de las ocho subunidades Gαi para la siguiente caracterización ya que se conocen proteínas efectoras fisiológicas para el resto de las subunidades Gαi (Gαt1, Gαt2 y Gαt3). ser cGMP fosfodiesterasa.

Para determinar las cantidades adecuadas de los plásmidos en el ensayo, probamos múltiples cantidades de plásmidos que codifican subunidades GPCR o Gαi y comparamos las curvas de concentración-respuesta. En primer lugar, medimos los niveles de expresión de membrana de MOR, un GPCR representativo utilizado en el estudio, valorando el plásmido que codifica MOR (100 ng de plásmido Gαi1 para todas las condiciones de MOR). A partir de una dosis de plásmido de 8 a 200 ng (por pocillo en una placa de 6 pocillos), los niveles de expresión aumentaron y su nivel no se elevó más en la condición de 1000 ng (Figuras complementarias 5a, b). Luego medimos la respuesta de AMPc mediada por Gi mediante el ensayo GloSensor. La curva de concentración-respuesta se desplazó hacia la izquierda a medida que aumentaba la cantidad de plásmido y se estabilizó en un volumen de 200 ng (Fig. 5c complementaria). Por lo tanto, utilizamos 200 ng de los GPCR de prueba de codificación de plásmidos en los experimentos posteriores. En el caso de Gα, fijamos el plásmido que codifica MOR en 200 ng y valoramos las cantidades de plásmido de las cinco subunidades Gαi de 1 a 1000 ng por 10 veces. Una dosis de plásmido de 1 ng mostró un efecto supresor de cAMP insignificante, mientras que una dosis de plásmido de 10 ng inhibió parcialmente la producción de cAMP (Fig. 5d complementaria). Las dosis de plásmido de 100 y 1000 ng inhibieron casi completamente la producción de AMPc. Observamos que, desde los volúmenes de plásmido de 10 a 1000 ng, la curva de concentración-respuesta tendía a desplazarse hacia la derecha a medida que aumentaba la dosis de plásmido. Juntos, los experimentos posteriores se realizaron con una dosis de plásmido codificante de Gαi de 100 ng.

Debido a que el ensayo GloSensor cAMP detecta predominantemente la activación de Gαs sobre Gαi, seleccionamos 11 GPCR que están acoplados a Gαi pero no a Gαs, que incluyen el receptor de dopamina D2 (D2R), el receptor de dopamina D4 (D4R), el receptor opioide tipo mu ( MOR), receptor de somatostatina tipo 2 (SSTR2), receptor de cannabinoides 1 (CB1), receptor de ácido lisofosfatídico 1 (LPA1), receptor de esfingosina 1-fosfato 1 (S1P1), receptor de esfingosina 1-fosfato 3 (S1P3), probable proteína G receptor acoplado 34 (GPR34), receptor de quimiocinas C-C tipo 2 (CCR2) y receptor de quimiocinas CC tipo 5 (CCR5). Se usaron ligandos endógenos que incluyen dopamina, serotonina, metionina-encefalina, somatostatina, ácido lisofosfatídico, esfingosina 1-fosfato, lisofosfatidilserina, CCL2 y CCL4 para todos los GPCR respectivos excepto para CB1, para el cual se utilizó un ligando sintético de alta afinidad (CP-55490) se utilizó porque los ligandos endógenos, como la anandamida, mostraron respuestas deficientes en el ensayo. Para cada GPCR, trazamos las respuestas de cAMP de las cinco condiciones Gαi y una condición no transfectada con Gαi (Fig. 4a, Fig. 6 complementaria). La inhibición de la acumulación de AMPc sobre las concentraciones de ligando valoradas se graficó y se ajustó con una curva de concentración-respuesta sigmoidal, a partir de la cual se obtuvieron los valores de la mitad de la concentración máxima (EC50) y la respuesta máxima (Emax) (Tabla complementaria 1). Encontramos patrones divergentes de acoplamiento de subunidades Gαi entre los 11 GPCR. En D2R, por ejemplo, todas las subunidades de Gαi analizadas dieron como resultado concentraciones de saturación equivalentes (correspondientes a los valores de Emax), pero la curva de concentración-respuesta en la condición que expresaba Gαo se desplazó hacia la izquierda, lo que refleja la diferencia en los valores de EC50. La preferencia de Gαo observada de D2R es consistente con estudios previos que usaron células Sf9 y subunidades de Gαi intactas que mostraron que D2R se acopla más efectivamente a Gαo26,27. En LPA1, por otro lado, las respuestas supresoras de cAMP en concentraciones saturadas fueron comparables entre Gαi1–3 y Gαo, mientras que la respuesta fue menor en Gαz.

a Curvas de concentración-respuesta de los ensayos de AMPc GloSensor en las células ∆Gαi que expresan transitoriamente Glo-22F con ciertas combinaciones de subunidades GPCR y Gαi. Las células se estimularon con forskolina 10 µM junto con las concentraciones indicadas de ligandos. Para cada experimento, la acumulación de AMPc inducida por forskolina se fijó en 100%. En todas las figuras, los símbolos y las barras de error representan la media y SEM, respectivamente, de tres experimentos independientes. Cada experimento se realizó por triplicado. Tenga en cuenta que para algunos puntos de datos, las barras de error son más pequeñas que el tamaño de los símbolos. b Diagrama esquemático que muestra el proceso para calcular los valores de RAi. c Mapa de calor de los valores de LogRAi para los 11 GPCR. Los colores van desde el blanco (LogRAi = −1,5) hasta el rojo (LogRAi = 0). Los receptores se organizan de acuerdo con el dendrograma del agrupamiento jerárquico, que se calculó a partir de los perfiles de acoplamiento.

Para comparar la selectividad de acoplamiento de la subunidad Gαi entre los receptores de manera uniforme, calculamos un parámetro conocido como actividad intrínseca relativa (RAi)28. El valor RAi es un único parámetro que considera tanto EC50 como Emax. Si bien RAi se usa comúnmente para evaluar el sesgo del ligando, lo usamos para evaluar la preferencia del receptor por las subunidades Gαi. Para cada curva sigmoidal, dividimos Emax por EC50 y normalizamos los valores Emax/EC50 resultantes por el valor máximo de Emax/EC50 entre las cinco subunidades Gαi probadas para generar valores Emax/EC50 relativos adimensionales (definidos como RAi, Fig. 4b). Además, transformamos logarítmicamente el valor RAi (LogRAi) y lo usamos como un índice de acoplamiento de subunidades Gαi. Aplicamos un análisis de conglomerados jerárquico para clasificar los GPCR y mostramos su índice de acoplamiento de subunidades Gαi como un mapa de calor con un árbol de agrupamiento (Fig. 4c). Observamos tres grupos en el análisis de agrupamiento. El grupo 1 (S1P1, CCR2, S1P3, D4R y MOR) se acopló eficientemente a Gαz, seguido de Gαi1–3 y Gαo. El grupo 2 (D2R) acoplado a Gαo, seguido de Gαi1–3, luego Gαz. El grupo 3 (CB1, CCR5, GPR34, SSTR2 y LPA1) no mostró selectividad por subunidades Gαi específicas. Comparamos el agrupamiento basado en acoplamiento Gαi con árboles filogenéticos GPCR. Según la similitud de aminoácidos y la agrupación de ligandos de GPCRdb (https://gpcrdb.org), los receptores probados se clasificaron en receptores de lípidos (LPA1, S1P1, S1P3, CB1), receptores huérfanos (GPR34), receptores aminérgicos (D2R , D4R), receptores de quimiocinas (CCR2 y CCR5) y receptores de péptidos (MOR, SSTR2). Curiosamente, esta clasificación es distinta del agrupamiento basado en acoplamiento. Estos resultados sugieren que, desde una perspectiva evolutiva, cada GPCR ha adquirido individualmente una selectividad variable de la subunidad Gαi29.

En este estudio, establecimos una línea celular HEK293A deficiente en Gαi, células ∆Gαi, para estudiar de manera más efectiva la preferencia de acoplamiento de la subunidad Gαi de los GPCR. Los investigadores han utilizado previamente PTX para inhibir las proteínas de la familia Gαi expresadas endógenamente. Sin embargo, se requieren mutantes insensibles a PTX para evaluar la señalización de la subunidad Gαi individual en condiciones tratadas con PTX. Además, PTX es incapaz de inhibir Gαz. Recientemente se descubrió que una toxina AB5 similar a la toxina de la tos ferina de Escherichia coli llamada OZITX inhibe todas las proteínas de la subfamilia Gαi, incluida la Gαz30,31. Incluso con esta toxina, se requiere una mutación C-terminal de Gαi, que puede afectar las propiedades de acoplamiento, para hacer que las proteínas de la subfamilia Gαi sean insensibles a OZITX. Las células ∆Gαi superan estos problemas experimentales y permiten la investigación no solo del acoplamiento de subunidades GPCR-Gαi, sino también de la señalización posterior de subunidades Gαi individuales e intactas.

La preferencia de acoplamiento de D2R por Gαo así como D4R por Gαz proporciona propiedades de señalización adecuadas para funciones fisiológicas. Gαz tiene una tasa de disociación de GDP espontánea lenta, así como una actividad de GTPasa intrínseca baja11. D4R se expresa en la retina y regula la naturaleza circadiana de la visión adaptada a la luz32,33. Tanto D4R como Gαz se expresan en las células fotorreceptoras y muestran un patrón de expresión diario que alcanza su punto máximo por la noche34. El acoplamiento eficiente de D4R y Gαz puede permitir la regulación de la naturaleza circadiana de la visión aprovechando las propiedades de activación a largo plazo de Gαz. Aunque D2R es filogenéticamente el más similar a D4R y juntos comprenden receptores similares a D2, D2R se acopla eficientemente a Gαo. A diferencia de Gαz, Gαo tiene una tasa de disociación espontánea de GDP más rápida que las otras subunidades de Gαi10. Por lo tanto, es probable que D2R posea propiedades de señalización de respuesta rápida a través de Gαo, lo que puede permitir una rápida transducción de señales entre neuronas. En conjunto, D2R y D4R probablemente utilizan la selectividad de acoplamiento diferencial para permitir la duración adecuada de los resultados de señalización dopaminérgica. Dado que las propiedades de señalización de los GPCR también dependen de los perfiles de expresión de Gα de las células y su localización, que son diferentes entre los tipos de células, las propiedades de señalización de D2R y D4R in vivo deben investigarse más a fondo en los estudios futuros.

MOR es un objetivo farmacológico importante para los analgésicos. En un estudio anterior que utilizó PTX y subunidades Gαi insensibles a PTX, MOR se acopló de manera más efectiva a Gαi3 y Gαo que a Gαi1 y Gαi214. Sin embargo, en nuestras condiciones experimentales, MOR se acopla de manera casi comparable con Gαi1-3 y Gαo. Aunque la diferencia en la cantidad de proteínas Gα entre los dos estudios también podría afectar el acoplamiento, esta diferencia observada puede deberse al uso de la mutación C-terminal en las subunidades Gαi en el estudio anterior para conferir resistencia a la PTX, lo que sugiere la importancia de evaluar la selectividad de la subunidad Gαi utilizando subunidades Gαi intactas. Además, medimos el acoplamiento de MOR para Gαz en paralelo con Gαi1-3 y Gαo sin modificaciones en las subunidades α. Los experimentos in vivo han revelado papeles diferenciales de los miembros de la familia Gαi en los efectos analgésicos inducidos por la morfina: Gαz en la administración crónica35,36 y Gαi2 y Gαo en la acción analgésica aguda37,38. Teniendo en cuenta los ligandos sesgados, que inducen una activación efectora distinta en el mismo receptor39,40,41, un agonista de MOR sesgado por Gαz podría conducir potencialmente al desarrollo de una analgesia de acción prolongada con una tolerancia posiblemente más baja. En conjunto, la evaluación de la selectividad de la subunidad Gαi de los agonistas de MOR puede, en última instancia, mejorar nuestra comprensión de las diferencias en la actividad de los fármacos y contribuir al descubrimiento de analgésicos más deseables.

Junto con nuestras células ∆Gαs, ∆Gαq y ∆Gα12 generadas anteriormente42,43,44, ahora tenemos un conjunto completo de cuatro líneas de células knock-out para Gα. Estas líneas celulares se pueden utilizar para investigar individualmente la señalización de Gα aguas abajo de los GPCR, lo que aumentará nuestra comprensión de la señalización de GPCR45 y, en última instancia, permitirá el desarrollo de fármacos con efectos terapéuticos más óptimos.

MetEnk (4042-v) y somatostatina (4023-v) se adquirieron de Peptide Institute. S1P (62570) y CP-55490 (90084) se adquirieron de Cayman Chemical. La dopamina (040-15433) se adquirió de FUJIFILM Wako Pure Chemical. LPA (867130) y LysoPS (858143) se adquirieron de Avanti Polar Lipid. CCL2 (Z03292) y CCL4 (Z02831) se adquirieron de Genscript. Los plásmidos utilizados en el ensayo de AMPc de Glosensor3 y el ensayo de desprendimiento de TGFα25 se describieron previamente.

Las células HEK293A (Thermo Fisher Scientific) y sus células ΔGαi derivadas se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Nissui Pharmaceutical) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Gibco, Thermo Fisher Scientific), penicilina al 0,006 % (p/v) y 0,01 % (p/v) de estreptomicina (DMEM completo), y se mantuvo a 37 °C en una incubadora humidificada equilibrada con CO2 al 5 %. Las transfecciones se realizaron utilizando una solución de polietilenimina (PEI) (Polietilenoimina "Max", Polysciences). Normalmente, las células HEK293 se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos a una densidad celular de 2 × 105 células por ml en 2 ml del DMEM completo y se cultivaron durante un día en una incubadora de CO2. Se mezcló una solución de transfección combinando solución de plásmido diluida en 100 µl de Opti-MEM (tecnologías Life) y 4 µl de solución de 1 mg por ml de PEI en 100 µl de Opti-MEM. Las células transfectadas se incubaron adicionalmente durante un día antes de someterlas a un ensayo como se describe a continuación.

Las células ΔGαi se obtuvieron mediante la estrategia iterativa de mutagénesis mediada por CRISPR/Cas9 ilustrada en la Fig. 1B. Las construcciones de sgRNA dirigidas a los genes GNAI1, GNAI2, GNAI3, GNAO, GNAZ, GNAT1 y GNAT2 se diseñaron utilizando el sitio web CRISPR.MIT.EDU (ya cerrado) para que un sitio de escisión de ADN mediado por SpCas9 (3 pb aguas arriba del secuencia de motivo adyacente al protoespaciador (PAM)) abarca un sitio de reconocimiento de enzima de restricción. Se sintetizó el oligonucleótido sentido y antisentido que codifica el ARN guía (FASMAC) y se insertó en el sitio BbsI del vector pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) (obsequio de Feng Zhang, Broad Institute, Cambridge, MA; plásmido Addgene No. .48138). La correcta inserción de las secuencias de ARN guía se verificó mediante secuenciación utilizando el método de Sanger (FASMAC). Las células HEK293A se sembraron en placas de 6 pocillos (1,0 × 105 células por ml en 2 ml de DMEM completo) y, 24 horas después, se transfectaron con una combinación de vectores PX458 dirigidos a los genes que codifican la subunidad Gαi utilizando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). Tres días después, las células se recolectaron y el 10-20 % superior de las células positivas para GFP se aislaron mediante un clasificador de células activado por fluorescencia (SH800; SONY). Las células aisladas se distribuyeron en placas de 96 pozos para expansión clonal. Los clones se analizaron en busca de mutaciones en los genes diana mediante PCR y digestión con enzimas de restricción utilizando un sistema de electroforesis capilar (MultiNA, Shimadzu). Los productos de PCR resistentes a enzimas de restricción se evaluaron en cuanto a sus alteraciones de ADN genómico mediante secuenciación directa o clonación TA. El direccionamiento exitoso se confirmó evaluando la inhibición de AMPc mediada por GPCR, como se describe a continuación. Las secuencias de oligonucleótidos que codifican los ARN guía, los cebadores de PCR utilizados para amplificar los sitios dirigidos a sgRNA y las enzimas de restricción utilizadas para digerir los productos de PCR se enumeran en la Tabla complementaria 2.

El ARN total de células HEK293 se preparó usando un kit GenElute Mammalian Total RNA Miniprep (Sigma-Aldrich). El ARN total se transcribió inversamente utilizando kits de RT de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las PCR cuantitativas en tiempo real se realizaron con TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara Bio) y se monitorearon con ABI Prism 7300 (Applied Biosystems). Los datos de expresión de ARN se normalizaron a la expresión de GAPDH. Las secuencias de cebadores de PCR se enumeraron en la Tabla complementaria 3.

La transfección del plásmido se realizó en una placa de 6 pocillos con una mezcla de 1 µg (por pocillo en una placa de 6 pocillos) del plásmido pCAGGS que codifica el biosensor cAMP Glo-22F (gen sintetizado con optimización de codones por Genscript), 200 ng de GPCR- plásmido codificante y 100 ng de plásmido codificante de la subunidad Gαi. Después de 1 día de incubación, las células transfectadas se recolectaron con D-PBS que contenía EDTA 0,53 mM, se centrifugaron a 190 g durante 5 min y se suspendieron en albúmina de suero bovino al 0,01 % (BSA, grado libre de ácidos grasos y libre de proteasas, Serva ) y HEPES 5 mM (pH 7,4) que contenía solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Las células se sembraron en una placa blanca de 96 pocillos (30 µl por pocillo) y se cargaron con solución potásica de D-luciferina (10 µl de solución 8 mM por pocillo; FujiFilm Wako Pure Chemical). Después de 2 horas de incubación en la oscuridad a temperatura ambiente, se leyó la placa para determinar su recuento luminiscente inicial (Spectramax L, Molecular Devices). Las células se trataron con un ligando solo (ensayo Gs) o forskolina 10 µM (FujiFilm Wako Pure Chemical) junto con un ligando (ensayo Gi) (10 µl de solución 5X por pocillo). Para la medición de la cinética, las placas se midieron durante 20 min y se expresaron como valores de cambio de pliegue. Las señales luminiscentes de cambio de pliegue de 16 min a 20 min después de la adición del compuesto se promediaron y normalizaron a aquellas en condiciones tratadas con forskoline. Utilizando el software Prism 9 (GraphPad Prism), las señales de AMPc se ajustaron a una curva de concentración-respuesta sigmoidal de cuatro parámetros, a partir de la cual se obtuvieron los valores EC50 y Emax. El agrupamiento jerárquico del perfil de acoplamiento se realizó en python utilizando el método Ward.

El ensayo de desprendimiento de TGFα se realizó como se describió anteriormente con modificaciones menores25. La transfección de plásmido se realizó en una placa de 6 pocillos con una mezcla de 500 ng (por pocillo en una placa de 6 pocillos) de plásmido que codifica AP-TGFα y 200 ng de plásmido que codifica GPCR. Después de 1 día de cultivo, las células transfectadas se recogieron mediante tripsinización, se sedimentaron mediante centrifugación a 190 g durante 5 min y se lavaron una vez con HBSS que contenía HEPES 5 mM (pH 7,4). Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en 6 ml de HBSS que contenía HEPES. La suspensión celular se sembró en una placa de cultivo de 96 pocillos (placa celular) a un volumen de 90 µl (por pocillo en adelante) y se incubó durante 30 min en un incubador de CO2. Las células se trataron con un ligando de GPCR (10x, diluido en HBSS que contenía HEPES 5 mM (pH 7,4) y BSA al 0,01 % (p/v). Después de girar las placas de células, se transfirieron 80 µl de medio acondicionado a un 96 vacío. -placa de pocillos (placa de medios acondicionados (CM)) En total, 80 µl de solución de reacción AP (p-nitrofenilfosfato 10 mM (p-NPP), Tris-HCl 120 mM (pH 9,5), NaCl 40 mM y MgCl2 10 mM) se dispensó en las placas de células y las placas de CM. Se midió la absorbancia a 405 nm de las placas, utilizando un lector de microplacas (SpectraMax 340 PC384, Molecular Devices), antes y después de 1 h de incubación a temperatura ambiente. AP-TGFα inducido por ligando la liberación se calculó restando la señal de liberación espontánea de AP-TGFα de la señal de liberación de AP-TGFα inducida por ligando.

El análisis de citometría de flujo se realizó como se describió previamente3. La transfección de plásmido se realizó en una placa de 6 pocillos con 1 µg (por pocillo en una placa de 6 pocillos) de Glo-22F, 100 ng de Gαi1 y una cantidad variable de plásmido que codifica MOR que alberga la secuencia señal de hemaglutinina N-terminal, seguido por la etiqueta del epítopo FLAG y un enlazador flexible de 15 aminoácidos. Las células transfectadas se recogieron añadiendo 300 µl de D-PBS que contenía EDTA 0,53 mM, seguido de 300 µl de HBSS que contenía HEPES 5 mM (pH 7,4). La suspensión celular se dispensó en una placa con fondo en V de 96 pocillos (200 µl por pocillo, dos pocillos por muestra). Después de la centrifugación a 700 g durante 1 min, las células se lavaron una vez con D-PBS y se sedimentaron. Los sedimentos celulares se suspendieron en suero de cabra al 2% y D-PBS que contenía EDTA 2 mM (tampón de bloqueo; 100 µl por pocillo) y se incubaron durante 30 min en hielo. Después de centrifugar a 700 g durante 1 min, las células se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-FLAG epitope tag (clon 1E6, FujiFilm Wako Pure Chemicals; 10 µg/ml en el tampón de bloqueo; 50 µl por pocillo) durante 30 min en hielo. Después de enjuagar con D-PBS, las células se marcaron con un anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; dilución de 10 µg/ml en el tampón de bloqueo; 25 µl por pocillo) durante 15 min en hielo. . Las células se lavaron una vez con D-PBS, se resuspendieron en 100 µl de D-PBS que contenía EDTA 2 mM y se filtraron a través de un filtro de 40 µm. Las células marcadas con fluorescencia (aproximadamente 20.000 células por muestra) se analizaron con el citómetro de flujo EC800 (Sony). La señal fluorescente derivada de Alexa Fluor 488 se registró en un canal FL1 y los datos de citometría de flujo se analizaron mediante un software FlowJo (FlowJo). Usamos todas las señales fluorescentes registradas y calculamos las intensidades medias de fluorescencia (MFI).

La transfección del plásmido se realizó en una placa de 6 pocillos con una mezcla de 500 ng de plásmido codificante de NES-LgBiT-miniGi1, cuya longitud de enlace entre LgBiT y miniGi1 se extendió a 15 aminoácidos de la construcción original46,47, y una cantidad variable de Plásmido MOR fusionado con SmBiT en el extremo C (con la secuencia señal de hemaglutinina en el extremo N, seguida de la etiqueta del epítopo FLAG y un conector flexible de 15 aminoácidos). Después de un cultivo de 1 día, las células transfectadas se recogieron con 1 ml de D-PBS que contenía EDTA 0,53 mM, seguido de la adición de 2 ml de HBSS que contenía HEPES. Las células se centrifugaron a 190 g durante 5 min y se resuspendieron en 2 ml de BSA al 0,01 % y HEPES 5 mM (pH 7,4) que contenía HBSS (tampón de ensayo). La suspensión celular se sembró en una placa blanca de cultivo de 96 pocillos (Greiner Bio-One) a un volumen de 80 µl (por pocillo a partir de ahora) y se cargó con 20 µl de solución de coelenterazina 50 µM (Carbosynth) diluida en el tampón de ensayo. Después de una incubación de 2 horas con coelenterazina a temperatura ambiente, se añadió manualmente MetEnk (6 µM, diluido en el tampón de ensayo) a las células (20 µl). Las señales luminiscentes se midieron cada 40 segundos después de la adición del ligando y se trazaron los valores luminiscentes promedio de 10 a 15 minutos.

Para el ensayo GloSensor cAMP y el ensayo de eliminación de TGFα, se realizaron tres experimentos independientes por duplicado y triplicado, respectivamente. Para el análisis cuantitativo de RT-PCR, se realizaron tres experimentos independientes por duplicado. Los símbolos y las barras de error representan valores medios y SEM de números indicados de experimentos independientes, respectivamente. Las curvas de concentración-respuesta se ajustaron a todos los datos mediante la regresión no lineal: pendiente variable (cuatro parámetros) en el Prisma 9 con una restricción de la pendiente de la colina de valor absoluto inferior a dos. Para el análisis de comparación múltiple, probamos la significación estadística mediante ANOVA de dos vías, seguido de la prueba post hoc indicada utilizando Prism 9.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados en el estudio se proporcionan en los Datos complementarios 1.

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Damos las gracias a Ritsuki Kuramoto de la Universidad de Tohoku por su ayuda en el análisis de agrupamiento; Ayaki Saito y otros miembros del laboratorio Inoue por la edición del manuscrito; Kazuhiro Kobayashi y Osamu Nureki en la Universidad de Tokio para la construcción miniGi1. AI fue financiado por las subvenciones KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) 21H04791, 21H05113, JPJSBP120213501 y JPJSBP120218801; Programa FOREST JPMJFR215T y Programa de Investigación y Desarrollo JST Moonshot JPMJMS2023 de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón (JST); BINDS JP22ama121038 de la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED); Fundación de Ciencias Takeda; Fundación Memorial Uehara. YO recibió JSPS KAKENHI 20J20669.

Bioquímica Molecular y Celular, Escuela de Graduados en Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Tohoku, Sendai, Miyagi, 980-8578, Japón

Yuki Ono, Kouki Kawakami, Gaku Nakamura, Satoru Ishida y Asuka Inoue

Departamento de Química de la Salud, Escuela de Graduados en Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Tokio, Bunkyo-ku, Tokio, 113-0033, Japón

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Conceptualización: YO y AI; Investigación: YO, GN, KK y SI; Redacción: YO, KK y AI con comentarios de todos los coautores. Adquisición de fondos: YO, JA y AI; Supervisión: JA y AI

Correspondencia a Asuka Inoue.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Bryan Roth, Ajith Karunarathne y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de Manejo Principal: Joao Valente.

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Ono, Y., Kawakami, K., Nakamura, G. et al. La generación de células HEK293 knock-out de Gαi ilumina la diversidad de GPCR de acoplamiento de Gαi. Comun Biol 6, 112 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04465-2

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Recibido: 03 Agosto 2022

Aceptado: 11 de enero de 2023

Publicado: 28 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04465-2

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